В качестве генетического маркера был специально разработан метод количественного определения доли мутантного аллеля в митохондриальном геноме. Митохондриальный геном характеризуется уникальным свойством, называемым термином «гетероплазмия», то есть это сочетание нормальных и мутантных молекул ДНК в самых разнообразных соотношениях. Для того, чтобы измерять эти соотношения и был разработан и опубликован вышеуказанный метод. В результате разработки и внедрения этого метода удается с достаточной долей точности количественно определять долю молекул, несущих мутантный аллель.
Была изучена в начале на аутопсийном материале взаимосвязь нескольких мутаций с атеросклеротическими поражениями сосудов человека. На морфологической карте участка человеческой аорты количеством точек отмечены участки сосуда, имеющие атеросклеротическую нагрузку, то есть участки без точек – нормальные, чем больше точек, – тем на этом участке более выражено атеросклеротическое изменение. Эти же участки были проанализированы на наличие различных мутаций митохондриального генома. Каждая отдельная мутация, не была явным образом связана с атеросклеротическими поражениями, хотя именно этим способом был идентифицирован набор мутаций, которые потенциально могли быть маркерами атеросклероза. На другой карте отмечена суммарная мутационная нагрузка, то есть посчитаны все мутации, взятые вместе, – чем их больше накапливается, тем большее влияние они имеют на сосудистую ткань. В результате наложения карт атеросклеротической и мутационной нагрузки митохондриального генома выявились достаточно большие области совпадений, и даже коэффициент корреляции вполне достоверен, что свидетельствует о том, что, независимо от других факторов риска (биохимических факторов, приводящих к появлению атеросклеротических поражений), мутации митохондриального генома являются самостоятельным действующим фактором. Таким образом, в результате этой части исследований были определены несколько мутаций, которые реально связаны с атеросклеротическим поражением, пока на уровне ткани. То есть где есть клетки, содержащие мутантные гены, там больше вероятность того, что в этом месте будет атеросклеротическое поражение, если нет этих мутаций – больше вероятность, что будет все в порядке.
Далее было интересно проверить, каким образом можно использовать такие маркеры в качестве прижизненных средств измерений. В жизни у человека такого соскоба не получишь и анализ там не проведешь, но можно взять кровь. В крови есть лейкоциты, часть которых – моноциты. Моноциты из циркулирующей крови проникают в сосудистую стенку, начинается атеросклеротический процесс, там они созревают в макрофаги. Макрофаги, на самом деле, идут туда не для того, чтобы вызвать атеросклероз, а для того, чтобы препятствовать его развитию, это их основная роль. Но, так или иначе, часть макрофагов по каким-то причинам превращается в «пенистые» клетки и наоборот начинает способствовать развитию атеросклероза и формированию того же самого некротического ядра атеросклеротической бляшки. А что, если эти моноциты, которые мигрировали в сосудистую стенку из кровотока, изначально дефектные, что, если они содержат какие-то мутации? Идея была о мутациях митохондриального генома. С ядерным геномом ничего не сделаешь, – все клетки одно и то же содержат, а вот по митохондриальному геному они могут отличаться. Дефектная клетка, которая пришла в субэндотелиальное пространство сосуда, возможно, не в состоянии справляться со своей ролью. Дело еще в том, что митохондриальные гены кодируют, в основном, белки дыхательной цепи – НАДН2-дегидрогеназы, компоненты АТФ-синтазы, цитохром b, т-РНК для аминокислот, митохондриальная р-РНК. То есть повреждение генов, которые кодируют синтез этих ферментов и прочего, приведет к нарушению сборки белка, если этих мутаций много, к избыточному окислительному стрессу, к появлению избыточного количества свободных радикалов со всеми вытекающими последствиями. То есть, не исключен такой вариант, что из-за мутаций митохондриального генома клетки реально становятся дефектными, а значит не справляются со своей ролью, и достаточно быстро погибают.