Материалом исследования служили образцы ткани из интимы аорты, печени и мышцы лиц, погибших в результате несчастного случая или внезапной смерти.
Кроме того, были исследованы образцы лейкоцитов крови у пациентов, входящих в группу риска: страдающих одним из заболеваний, наиболее часто ассоциированных с атеросклерозом (артериальной гипертонией, сахарным диабетом 2 типа, ишемической болезнью сердца, острым инфарктом миокарда, бронхиальной астмой, нарушением мозгового кровоснабжения) или здоровых мужчин старше 40 лет и женщин старше 50 лет.
Для прижизненной диагностики атеросклероза использовали ультрасонографию высокого разрешения в В-режиме с использованием линейного сосудистого датчика с частотой 7,5 МГц с последующей компьютерной оценкой толщины интимо-медиального слоя (ТИМС) общих сонных артерий.
Выделение ДНК из образцов различных тканей или лейкоцитов крови проводилось с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Визуализацию выделенной ДНК проводили с помощью электрофореза в горизонтальном аппарате в 0,8% агарозном геле.
Затем был проведён ряд ПЦР с праймерами на область мутаций. Условия проведения реакции для различных мутаций были специально подобраны в предварительных экспериментах.
Амплификаты были пиросеквенированы для выявления точечных замен или микроделеций с помощью соответствующих праймеров для сиквенса. Исследования проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQTMHS96MA. Визуализация результатов осуществлялась с помощью программы, прилагающейся при установке пиросеквенатора.
Обработку данных проводили при помощи статистического пакета SPSS 14.0 (SPSS Inc., США). Полученные данные представляли в виде среднего значения с указанием стандартного отклонения.
В целях определения критического уровня гетероплазмии митохондриальных мутаций, ассоциированного с возникновением и развитием патологий в организме человека, нами был разработан новый оригинальный метод количественной оценки митохондриального генома, основанный на пиросеквенировании коротких фрагментов ДНК.