Метод пиросеквенирования основан на измерении вспышки, возникающей при взаимодействии АТФ, образующейся из пирофосфата с помощью сульфаразы, с люциферином. Данная реакция катализируется люциферазой. Пирофосфат (давший название всему методу пиросиквенса), в свою очередь, выделяется при взаимодействии нуклеотида, комплементарного нуклеотиду исследуемого биотинилированного одноцепочечного участка, с сиквенсовым праймером или очередным соседним нуклеотидом, которые уже встроены в комплементарную цепь. Если же добавляемый в реакцию нуклеотид не комплементарен изучаемому участку ДНК, то выделения пирофосфата, а следовательно, и вспышки, не происходит. Интенсивность вспышки кратна количеству встроившихся нуклеотидов в комплементарной цепи

В настоящее время описаны различные методы количественной оценки уровня гетероплазмии, например, с помощью ПЦР в режиме реального времени, анализа гетеродуплексов и микрочипов. Однако эти методы имеют довольно существенный недостаток – значительно меньшую точность. При использовании данных методов размер анализируемой последовательности в среднем составляет 50-600 п.н. При этом минимальный уровень гетероплазмии, определяемый с высокой достоверностью, составляет 25%. Напротив, пиросеквенирование обеспечивает возможность анализа области исследуемой мутации на очень короткой последовательности нуклеотидов – 5-10 п.н., что значительно увеличивает точность определения процента гетероплазмии мутантного аллеля. При этом минимальный уровень гетероплазмии, определяемый пиросеквенатором выше фоновых значений, составляет 4%. На сегодняшний день данный метод называют «золотым стандартом» определения не только процента гетероплазмии, но и мутантного или нормального аллеля в ядерной ДНК, благодаря его высокой точности.

Новый оригинальный метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома, разработанный и апробированный в нашей лаборатории, основан на анализе высоты пиков пирограммы в исследуемой области одноцепочечного ПЦР-фрагмента. Наша задача заключалась в оценке процента гетероплазмии по исследуемой мутации. Пирограмма для митохондриальных генов отличается от таковой для ядерных, так как для последних существует чёткое разделение на гомо- и гетерозигот, что делает высоту пиков на пирограмме фиксированной (0% - индивид гомозиготен, оба аллеля не несут мутации, 50% - гетерозигота, и 100% - пациент гомозиготен, оба аллеля мутантны). Для мутаций же митохондриального генома, проанализировав отличия в последовательности и размере пиков для гомозигот, имеющих 100% нормальных и 100% мутантных аллелей, мы можем определить процент гетероплазмии в образце ДНК для каждой конкретной мутации. Общая формула для подсчёта процента гетероплазмии выглядит следующим образом:

   ,

где P – процент гетероплазмии;

h – высота пика исследуемого нуклеотида;

N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей;

M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей.

Примеры расчета процента гетероплазмии мутаций митохондриального генома.