Грачев АН, Карагодин ВП, Мясоедова ВА, Кириченко ТВ, Рудимов ЕН, Орехова ЕА, Хренов МО, Авхачева НВ, Мубаракшина ЭК, Кжышковская ЮГ, Орехов АН
Бюллетень Московского общества испытателей природы 2009  114(3):291-296

Общеизвестно, что снижение иммунитета из-за неблагоприятной экологии существенно усложняет течение острых и хронических заболеваний. В частности, важнейшим фактором в развитии атеросклероза являются нарушения в системе иммунитета, ведущие к развитию инфекций, повреждений в слизистой оболочке сосудов и воспалительных процессов [1].
Для успешного использования потенциала иммунной системы при предотвращении и лечении различных патологий необходимо изучать активность и индивидуальные особенности макрофагов, том числе при антропогенных воздействиях. В современной биологии используются различные способы выделения моноцитов периферической крови [2-6], однако до сих пор оптимизация методики выделения первичных человеческих моноцитов проведена не была. Нами предпринята попытка создания эффективной и недорогой методики получения моноцитов, что является ключевым этапом в разработке тест-системы для определения иммунного статуса человека.
 

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

   
Моноциты выделяли из побочных продуктов приготовления консервов крови – лейкоцитной пленки. Лейкоцитную пленку разводили буфером PBS, содержащим Ca²⁺ и Mg²⁺ (Biochrom) в соотношении 1:1. Полученную суспензию (35 мл) наслаивали на 15 мл фикола плотности 1.077 (Biochrom) в пробирке Leucosep^TM (Greiner). Образцы центрифугировали 30 мин (Backman Coulter) при 650xg. Мононуклеарную фракцию собирали с интерфазы фикол/сыворотка, переносили в свежие пробирки и два раза отмывали буфером PBS. Во время первого центрифугирования готовили непрерывный градиент на основе перкола (Percoll^TM GE Healthcare). Полученную смесь помещали в 50 мл пробирку и центрифугировали при 12000xg в течение 10 мин при 20⁰С с отключенными тормозами в роторе F34-6-38 (Eppendorf). Отмытые клетки (5-8x10⁸) ресуспендировали в 5 мл PBS и наносили на полученный градиент. Градиенты центрифугировали при 650xg в течение 30 мин при 20⁰С с отключенными тормозами. В результате центрифугирования популяция клеток разделялась на две фракции. Фракция, находившаяся в верхней части градиента содержала клеточную суспензию обогащенную моноцитами до 60-80%. Эту фракцию собирали, и 3 раза отмывали буфером PBS. Полученная клеточная популяция была использована для некоторых экспериментов напрямую. При необходимости получения популяций клеток, содержащих более 90% моноцитов, обогащенная моноцитами фракция, использовалась для магнитной сортировки CD14+ клеток при помощи набора для выделения моноцитов (Miltenyi Biotech). Полученная таким образом клеточная популяция содержала 92-95% моноцитов, что контролировалось при помощи анализа поверхностной экспрессии маркера моноцитов CD14. Макрофаги культивировали в концентрации 1x10⁶ клеток/мл в бессывороточной среде X-VIVO 10^TM (Cambrex), содержащей цитокины.
Для получения кДНК использовались наборы для синтеза кДНК фирмы Invitrogen, содержащие обратную транскриптазу SuperScript II или SuperScript III. Применение этих наборов позволяло получать достаточное количество кДНК при использовании 100 нг тотальной РНК. Синтез проводился в строгом соответствии с рекомендациями производителя. Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием коммерческих реагентов для определения цитокинов CCL18, IL-1, IL-1ra, ФНО. Олигонуклеотиды для определения GAPD- гена, использовавшегося для нормализации полученных данных, представлены в Приложении Б. Для постановки реакция использовали готовую реакционную смесь фирмы AppliedBiosystems(Darmstadt, Germany). Концентрацию цитокинов в культуральной среде определяли при помощи наборов для ELISAфирмы R&Dsystems(Wiesbaden, Germany).
 

РЕЗУЛЬТАТЫ

   
На начальном этапе сравнивали три метода выделения первичных моноцитов крови: 1) метод, основанный на клеточной адгезии; 2) метод, использующий центрифугирование в градиенте плотности; и 3) метод сортировки клеток с использованием парамагнитных наночастиц, конъюгированных с антителами к CD14. Для оптимизации метода в качестве исходного материала использовали побочный продукт приготовления концентрата эритроцитов - лейкоцитарную пленку. На начальном этапе для всех трех методик мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получали путем центрифугирования крови на подушке Фикола. Полученные клетки отмывали 3 раза фосфатным буфером и использовали для выделения моноцитов.
Метод 1. Выделение моноцитов методом клеточной адгезии. МКПК ресуспендировали в бессывороточной среде X-vivo10 из расчета 10⁶ клеток на 1 мл и переносили на чашки Петри из расчета 10 мл на чашку. Чашки инкубировали при 37°С в течение 45 минут. После инкубации неприкрепившиеся клетки отмывали 3 раза фосфатным буфером. Прикрепившиеся клетки либо соскабливали для дальнейшего анализа, либо культивировали непосредственно на чашке.
Метод 2. Выделение моноцитов методом центрифугирования в градиенте плотности. Для разделения МКПК по плотности использовали непрерывный градиент перкола. Градиент перкола получали следующим образом. 30 мл изотонического раствора перкола переносили в 50 мл пробирки и центрифугировали 10 мин при 14000 g и комнатной температуре с отключенными тормозами. МКПК ресуспендировали в фосфатном буфере из расчета 10⁸ клеток на 5 мл и наслаивали на полученный градиент. Образцы центрифугировали 30 мин при 400 g и комнатной температуре. После центрифугирования верхняя клеточная фракция содержала преимущественно моноциты. Полученные клетки либо использовали для дальнейшего анализа, либо ресуспендировали в среде X-vivo10 из расчета 10⁶ клеток на мл и культивировали.
Метод 3. Выделение методов методом магнитной сортировки. МКПК ресуспендировали в буфере для магнитной сепарации из расчета 1е7 клеток на 90 мкл и добавляли 10 мкл коллоидного раствора наночастиц на каждые 90 мкл клеточной суспензии. Полученную суспензию инкубировали при 10°С в течение 15 минут. После инкубации образцы наносили на колонку, помещенную в магнитный сепаратор. Колонку промывали 3 раза 3 мл буфера для магнитной сепарации. После промывки колонку извлекали из сепаратора и переносили в стерильную пробирку объемом 15 мл. Клетки, помеченные парамагнитными наночастицами, оставшиеся на колонке элюировали 5 мл буфера для магнитной сепарации. После элюции клетки отмывали 2 раза стерильным фосфатным буфером и ресуспендировали из расчета 10⁶ клеток/мл в среде X-vivo 10 для последующего культивирования.
Непосредственно после выделения в полученной клеточной популяции исследовали процент моноцитов при помощи проточной цитометрии. Для этого клетки ресуспендировали в буфере для проточной цитометрии из расчета 10⁵ клеток на 100 мкл. К полученной суспензии добавляли 5 мкл меченных FITCантител к CD14 или меченных FITCконтрольных антител. Образцы инкубировали 40 мин при комнатной температуре в темноте. После инкубации клетки отмывали 3 раза в 500 мкл буфера для проточной цитометрии и анализировали.

Таблица 1. Процент CD14-положительных клеток в полученной клеточной популяции

 
Исходя из полученных данных  (табл.1), очевидно, что метод магнитной сепарации позволяет получить наиболее высокую чистоту клеточной популяции и обеспечивает наиболее воспроизводимые результаты. Недостатком метода является высокая стоимость парамагнитных наночастиц для выделения клеток. С целью снижения стоимости выделения моноцитов метод был модифицирован. Модифицированный протокол выделения содержал дополнительный этап обогащения МКПК моноцитами при помощи центрифугирования в непрерывном градиенте перкола перед магнитной сортировкой. Данная модификация позволила увеличить выход моноцитов в 4-5 раз в зависимости от донора. Увеличение длительности протокола составило лишь 30% от длительности исходного протокола.
Так как в процессе выделения моноцитов с использованием разработанного протокола происходит лигирование ко-рецептора к липополисахариду (ЛПС), необходимо было исследовать влияние этого лигирования на активацию моноцитов. Для этого полученные моноциты ресуспендировали в среде X-vivo10 в концентрации 10⁶ клеток/мл и высевали в 24-х луночные плашки.      Для получения положительного контроля активации моноцитов клетки стимулировали ИФН-гамма в концентрации 100 нг/мл или ИЛ-4 в концентрации 10 нг/мл. В качестве отрицательного контроля использовали чистую культуральную среду без добавления клеток и цитокинов. Анализ проводили в 5 независимых экспериментах по 3 донора на эксперимент. Общее количество доноров – 15. Для анализа экспрессии мРНК клетки готовили, как описано выше и культивировали в течение 3 и 5 дней. По истечении срока культивирования в культуральной жидкости измеряли концентрации ИЛ-1, ФНО, CCL18 и IL-1ra, а также собирали клетки и использовали их для выделения тотальной РНК и синтеза кДНК. Полученная кДНК была использована в качестве матрицы для анализа экспрессии мРНК цитокинов методом количественной ПЦР.
Для измерения концентраций ИЛ-1, ФНО, CCL18 и IL-1raиспользовали методику иммуноферментного анализа (ИФА). Макрофаги культивировали в течение 3 или 5 дней, после чего культуральную среду собирали, центрифугировали 10 мин при 5000 х gи переносили в свежие пробирки.
Для измерения концентраций цитокинов методом ИФА за сутки до постановки эксперимента антитела для захвата антигена наслаивали в лунки 96-и луночных плашек. Для этого раствор антител распределяли по лункам плашек MaxiSorp (Nunc) из расчета 100 мкл на лунку. Готовую плашку инкубировали в течение 18 часов при 4°С. После наслаивания антител, оставшиеся места для связывания блокировали раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере. Готовую плашку немедленно использовали для иммуноферментного анализа. В лунки плашки наносили последовательные разведения стандарта антигена для построения калибровочной кривой и образцы культуральной жидкости в повторах. Пример распределения образцов для определения концентрации ФНО представлен в Приложении И.
Образцы, нанесенные в лунки плашки, инкубировали в течение 2-х часов при комнатной температуре и постоянном помешивании. После инкубации плашку отмывали 3 раза буфером для иммуноферментного анализа и наносили раствор антител для определения антигена, конъюгированных с биотином. После 1-часовой инкубации плашку отмывали 3 раза буфером для иммуноферментного анализа и наносили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Плашку инкубировали в течение 20 минут и отмывали 3 раза буфером для иммуноферментного анализа. Ферментативную активность определяли при помощи готового субстрата для пероксидазы хрена на основе тетраметилбензидина. Реакцию останавливали добавлением 0,2 M серной кислоты. Далее при помощи планшетного спектрофотометра определяли оптическую плотность полученных образцов. На основании оптических плотностей образцов, содержащих контрольный белок, строили калибровочную кривую.
Измерения показали, что при отсутствии стимуляции культивируемые макрофаги не производили ни один из вышеупомянутых цитокинов. При этом легко детектируемые концентрации соответствующих цитокинов определялись в пробах, подготовленных в качестве положительных контролей.
Измерение относительной экспрессии мРНК цитокинов в макрофагах проводили при помощи технологии ТэкМэн с использованием зондов, помеченных флуоресцентными красителями FAMи VIC. В качестве гена для нормализации уровня экспрессии цитокинов использовали ген GAPD– глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы. Эксперименты показали, что процесс выделения макрофагов не приводит к активации экспрессии мРНК вышеперечисленных цитокинов. На основании полученных данных был сделан вывод, что разработанная методика выделения первичных моноцитов периферической крови не приводит к активации макрофагов.
Для анализа способности макрофагов, полученных их моноцитов, выделенных методом магнитной сортировки, реагировать на соответствующие стимулы моноциты стимулировали ИФН-гамма в концентрации 100 нг/мл или ИЛ-4 в концентрации 10 нг/мл. После 3 и 5 дней культивирования в культуральной среде методом ИФА определяли концентрации ИЛ-1, ФНО, CCL18 и IL-1ra. Для исследования способности проявлять провоспалительную активность в ответ на экзогенные факторы макрофаги на 3 и 5 день стимулировали ЛПС в концентрации 1 мкг/мл. Клетки культивировали в течение 6 часов и измеряли концентрацию ИЛ-1, ФНО в культуральной среде методом ИФА. Анализ проводили в 5 независимых экспериментах по 3 донора на эксперимент с использованием лейкоцитарной пленки как источника клеток.
Измерения показали, что макрофаги, полученные с использованием разработанной методики, эффективно отвечали как на ИЛ-4, так и на ИФН-гамма, производя соответствующий противо- или провоспалительные цитокины. Использование для стимуляции макрофагов ЛПС приводило к эффективной продукции ФНО и ИЛ-1 всеми популяциями макрофагов.
На основании полученных данных можно заключить, что разработанная методика получения моноцитов периферической крови позволяет исследовать как способность клеток адекватно отвечать на про- и противовоспалительные стимулы, так  и изучать маркеры макрофагов, характерные для различных физиологических ситуаций.

Литература:
1 Бовтюшко В.Г., Поддубский Г.А. Определение количественной меры риска развития атеросклероза у людей, работающих в экологически неблагоприятных условиях. // Международные медицинские обзоры. 1994.- Т. 2., №4.стр. 273-278.
2 GratchevA., KzhyshkowskaJ., KannookadanS., etal. Activation of a TGF-{beta}-Specific Multistep Gene Expression Program in Mature Macrophages Requires Glucocorticoid-Mediated Surface Expression of TGF-{beta} Receptor II. // J. Immunol.-2008.-Vol.180-pp.6553-6565.
3 Gratchev A., Guillot P., Hakiy N., et al. Alternatively activated macrophages differentially express fibronectin and its splice variants and the extracellular matrix protein betaIG-H3. // Scand. J. Immunol.-2001.-Vol.53-pp.386-392.
4 Gratchev A., Kzhyshkowska J., Utikal J., et al. Interleukin-4 and dexamethasone counterregulate extracellular matrix remodelling and phagocytosis in type-2 macrophages. // Scand. J. Immunol.-2005.-Vol.61-pp.10-17.
5 Metharom, P., F. W. Velten, and S. Goerdt. 2006. Highly phagocytic, CD4hi, CD14hi and CD16hi antigen-presenting cells modulated by tumour-conditioned media retain the capacity to mature and induce TH1 T-cell proliferation. Mol.Immunol. 43:2070-2082.
6 Perseghin, P., G. D'Amico, E. Dander, G. Gaipa, M. Dassi, E. Biagi, and A. Biondi. 2008. Isolation of monocytes from leukapheretic products for large-scale GMP-grade generation of cytomegalovirus-specific T-cell lines by means of an automated elutriation device. Transfusion  48:1644-1649.