Букринский МИ, Свиридов ДД, Карагодин ВП, Собенин ИА, Сазонова МА, Коренная ВВ, Орехова ВА, Иванова ММ, Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Савинкова ИГ, Орехов АН
Бюллетень Московского общества испытателей природы 2009 114(3):297-301
 

Снижение способности организма противостоять неблагоприятным факторам внешней среды часто является следствием вирусной инфекции. Преодолевая иммунную систему хозяина, вирус наносит ей существенный урон. Это особенно ярко проявляется при инфицировании вирусом иммунодефицита человека. Помимо разрушения иммунной системы, ВИЧ способен вызывать другие заболевания. В частности, существует связь между ВИЧ-инфекцией и повышенным риском развития атеросклероза. Однако причины этого явления не установлены и являются предметом дискуссии.
Важнейшим проявлением атеросклероза, служащим триггером возникновения и развития атеросклеротического поражения, является накопление холестерина в артериальных клетках. Клеточный гомеостаз холестерина критически зависит от способности клеток освобождаться от избытка холестерина, используя механизм обратного транспорта холестерина. Основную роль в обратном транспорте холестерина играют липопротеиды высокой плотности (ЛВП), содержащие аполипопротеин A-I (apoA-I), и клеточные АВС-транспортеры. Описано несколько основных механизмов обратного транспорта холестерина. Зависимый от АВСА1 механизм заключается в липидировании  apoA-I клеточными липидами [1]. Это главный путь оттока холестерина для многих типов клеток. В отсутствие АВСА1 клетки не могут передавать липиды на делипидированный ароA-I и освобождаться от избытка холестерина.
Предполагалось выяснить, использует ли ВИЧ АВСА1-зависимый путь обратного транспорта холестерина, чтобы перевести поток холестерина на липидные рафты плазматической мембраны клетки, где происходит сборка вируса.
 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты с РНК ингибированием.
Клетки трансфецировали ABCA1 миРНК или контрольной миRNA (150 пмоль/10⁶ клеток), закупленной у Santa Cruz Biotechnology.  Трансфекцию проводили, используя Metafectene (Biontex) согласно протоколу производителя. 
Рафты, устойчивые к детергенту. 
Фракция плазматических мембран получалась равновесной флотацией при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Для приготовления препаратов использовали 10⁸ клеток, которые лизировали 30 мин при 0°С в присутствии 1% Тритона X-100 в TNE (20 мM Трис-HCL, pH 7,5, 150 мM NaCl, 5 мM ЭДТА) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Roche). Лизаты гомогенизировали 10 проходами в гомогенизаторе Даунса, затем ядерный и клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин при 4°C.  Супернатант смешивали с равным объемом 80% сахарозы в TNE, последовательно наслаивая 35% и 5% сахарозы в TNE, после чего центрифугировали при 35000 об/мин в течение 24 ч при 4°C.  Отдельные фракции собирали и солюбилизировали в 1% N-додецил-β-D-мальтозиде. Фракция рафтов и фракции, не содержащие рафты, идентифицировали с помощью Вестерн блота с помощью гликосфинголипида GM1 и рецептора к трансферрину, соответственно, которые использовались в качестве маркеров. Для выявления GM1 была использована субъединица В холерного токсина, конъюгированная с пероксидазой хрена. Для выявления рецептора к трансферрину использовались анти-трансферриновые антитела  (Zymed) с последующим выявлением при использовании мышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена в качестве вторых антител. Фракции нормировали на общий белок. Содержание холестерина в рафтах определяли с использованием Amplex Red Cholesterol Assay (Molecular Probes).
 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы сравнивали содержание холестерина в липидных рафтах клеток HeLa (эти клетки не экспрессируют АВСА1) с клетками HeLa-АВС1 (клетки HeLa, стабильно трансфецированные вектором, экспрессирующим АВСА1). Эти эксперименты выявили, что клетки, экспрессирующие АВСА1, имеют значительно меньшее содержание холестерина во фракции липидных рафтов по сравнению с контрольными клетками HeLa (Рис. 1А). Это указывает на то, что АВСА1 снижает холестерин в липидных рафтах.
Для дальнейших исследований роли АВСА1 в регуляции холестерина липидных рафтов в физиологической системе мы использовали клетки RAW264.7 – линию клеток мышиных макрофагов. Экспрессия АВСА1 в этих клетках контролируется ядерным рецептором LXR и может быть стимулирована добавлением к клеткам агонистов LXR. Как показано на Рис. 1В, стимуляция клеток RAW264.7 с использованием TO-901317, синтетического агониста LXR, приводит к существенному снижению холестерина липидных рафтов. Эффект агониста LXR значительно ослаблялся, когда экспрессия АВСА1 блокировалась малой ингибирующей РНК (миРНК). Примечательно, что миРНК не изменяла существенно холестерин липидных рафтов у клеток RAW264.7, которые не были стимулированы агонистом LXR; причиной этого, по-видимому, является очень низкая экспрессия АВСА1 в нестимулированных клетках RAW264.7.
Результаты этих экспериментов демонстрируют выраженный эффект АВСА1 на холестерин липидных рафтов: подавление экспрессии АВСА1 повышает содержание холестерина липидных рафтов, в то время как стимуляция АВСА1 снижает его.
Селективное разрушение АВСА1 в макрофагах приводит к нарушению обратного транспорта холестерина [2], накоплению холестерина в клетках и развитию атеросклероза [3]. Мутации АВСА1 вызывают болезнь Танжера, заболевание, характеризующееся отсутствием ЛВП и не работающим обратным транспортом холестерина [4]. У мышей, нокаутных по АВСА1, в плазме крови не обнаруживаются ЛВП, а в макрофагах накапливается холестерин [5]. Напротив, у трансгенных мышей-овер-экспрессоров АВСА1 отмечается высокий уровень ЛВП в крови, повышенный обратный транспорт холестерина и высокая резистентность к атеросклерозу  [6].  Недавно стало известно еще об одном АВС-транспортере, вовлеченном в отток холестерина – это ABCG1 [7]. Этот транспортер является медиатором оттока холестерина на насыщенные липидами зрелые ЛВП, но не на apoA-I с низким содержанием липидов.  Два АВС-траспортера могут работать в тандеме, когда ABCA1 насыщает липидами apoA-I, имеющий низкое содержание липидов, а ABCG1 продолжает насыщать ЛВП липидами, добавляя дополнительный холестерин [8].  В оттоке холестерина могут принимать участие и другие АВС-транспортеры, например, ABCA7 [9, 10].
Существуют два возможных механизма, благодаря которым ВИЧ может нарушить обратный транспорт холестерина: 1) Вирусный белок Nef, обладающий широкой активностью, модифицирует АВСА1-зависимый путь оттока холестерина таким образом, что вместо доставки холестерина к участкам плазматической мембраны для дальнейшего оттока холестерина через apoA-I, холестерин направляется на липидные рафты где собираются вирионы ВИЧ (механизм «грабежа»); 2) ВИЧ блокирует АВСА1-зависимый путь, направляя перенос неиспользованного холестерина на липидные рафты через Nef-зависимый путь (механизм «подавления»).
Механизм грабежа предполагает участие как АВСА1, так и Nef в доставке холестерина к участкам вирусной структуры, тогда как в механизме подавления Nef просто блокирует ABCA1-зависимый отток холестерина, а затем транспортирует высвобожденный холестерин к продуцируемым вирионам без участия АВСА1. Установление различий между этими двумя механизмами – вопрос чрезвычайной важности в поиске подходящей мишени для подавления накопления липидов в клетке. Выяснение молекулярного механизма метаболизма липидов, нарушенного ВИЧ-инфекцией, а также роли, которую этот метаболизм играет в биологии ВИЧ, может привести к новым подходам к контролю репликации ВИЧ. Кроме того, в результате подобных исследований могут возникнуть новые идеи в отношении того, как лечить нарушения липидного обмена, вызванные ВИЧ-инфекцией. Чтобы исследовать механизм оттока холестерина, нарушенный Nef, будут изучены следующие вопросы.
В настоящей работе мы пытались ответить на вопрос, повышает или снижает специфическое подавление или стимуляция АВСА1-зависимого механизма оттока холестерина доставку холестерина к участкам вирусной структуры (липидным рафтам).
Анализ ситуации позволяет проверить, использует ли ВИЧ активно АВСА1-зависимый путь, чтобы насытить липидные рафты холестерином. Если гипотеза «грабежа» правильна, ингибирование АВСА1-зависимого пути подавит перенос холестерина на липидные рафты, если же правильна гипотеза «подавления», то будет наблюдаться стимуляция доставки холестерина к рафтам. Нам удалось показать, что подавление экспрессии АВСА1 повышает содержание холестерина липидных рафтов, в то время как стимуляция АВСА1 снижает его. Таким образом, правильна гипотеза «подавления».

Литература:
1. Oram, J.F., Lawn, R.M. ABCA1. The gatekeeper for eliminating excess tissue cholesterol. // J. Lipid. Res. – 2001. - Vol. 42 - P. 1173-1179.
2. Wang, X., Collins, H.L., Ranalletta, M., et al. Macrophage ABCA1 and ABCG1, but not SR-BI, promote macrophage reverse cholesterol transport in vivo. // J. Clin. Invest. - 2007. - Vol. 117 - P. 2216-2224.
3. Aiello, R.J., Brees, D., Bourassa, P.A., et al. Increased atherosclerosis in hyperlipidemic mice with inactivation of ABCA1 in macrophages. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. -2002. -Vol. 22 - P. 630-637.
4. Oram, J.F. Tangier disease and ABCA1. // Biochim. Biophys. Acta. -2000. - Vol. 1529 - P. 321-330.
5. Aiello, R.J., Brees, D., Francone, O.L. ABCA1-Deficient Mice: Insights Into the Role of Monocyte Lipid Efflux in HDL Formation and Inflammation. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2003.,- Vol.23 - P. 972-980.
6. Joyce, C.W., Amar, M.J.A., Lambert, G., et al. The ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) modulates the development of aortic atherosclerosis in C57BL/6 and apoE-knockout mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2002. - Vol. 99 - P. 407-412.
7. Wang, N., Lan, D., Chen, W., et al. ATP-binding cassette transporters G1 and G4 mediate cellular cholesterol efflux to high-density lipoproteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2004. - Vol. 101 - P. 9774-9779.
8. Gelissen, I.C., Harris, M., Rye, K.A., et al. ABCA1 and ABCG1 synergize to mediate cholesterol export to apoA-I. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2006. - Vol. - 26 - P. 534-540.
9. Linsel-Nitschke, P., Jehle, A.W., Shan, J., et al. Potential role of ABCA7 in cellular lipid efflux to apoA-I. // J. Lipid. Res. - 2005. - Vol. - 46 - P. 86-92.
10. Kim, W.S., Fitzgerald, M.L., Kang, K., et al. Abca7 null mice retain normal macrophage phosphatidylcholine and cholesterol efflux activity despite alterations in adipose mass and serum cholesterol levels. // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. - 280 - P. 3989-3995.
Lang, T. How to Report Statistics in Medicine. // N. Y. : Am. Coll. Physicians. – 2007. 548 P.
12. Neufeld, E.B., Remaley, A.T., Demosky, S.J., et al. Cellular Localization and Trafficking of the Human ABCA1 Transporter. // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276 - P. 27584-27590.






Рисунок 1 - ABCA1 регулирует уровень холестерина липидных рафтов
 
A. Клетки HeLa и клетки HeLa, стабильно трансфецированные GFP-ABCA1 (HeLa-ABCA1) по методу Neufeld [12] разделялись на фракцию, содержащую рафты и не содержащую рафты как описано в подписи к рисунку 1В. Фракции липидных рафтов пулировали и анализировали количество холестерина с помощью Amplex Red Cholesterol Assay Kit (Molecular Probes).  Представлены репрезентативные результаты одного из трех проведенных экспериментов. Значение Р (указаны над столбиками) тройного определения оценивалось с использование t-критерия Стьюдента.
B. К клеткам RAW264.7, трасфецированным  АВСА1-нацеленной или контрольной малой ингибирующей РНК (миРНК), добавляли или не добавляли 1 мкМ TO-901317, лизированного холодным (0°С) Тритоном Х-100. Клетки фракционировали для получения фракции рафтов и фракции, не содержащей рафтов, равновесным флотированием при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Собирали фракцию, содержащую GM1 (фракция, обогащенная липидными рафтами), а также фракцию TR, содержащую трансферриновый рецептор (фракция, не содержащая белков рафтов). 
C. Фракции, обогащенные GM1, (Рис. 1В) анализировали на содержание холестерина с помощью Amplex Red Cholesterol Assay. Результаты анализа нормировали на содержание общего белка. Содержание холестерина дано как процент от содержания холестерина в рафтах, выделенных из контрольных клеток. Значение Р (показано над столбиками) оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Представлены репрезентативные данные одного из двух проведенных экспериментов.