Орехов АН, Собенин ИА, Орехова ВА, Мельниченко АА, Мясоедова ВА, Мухамедова НМ, Свиридов ДД, Карагодин ВП.
Проблемы и перспективы современной науки 2011 3(1): 98-103
 

Введение

Атеросклероз является многофакторным заболеванием, для которого характерно развитие дегенеративных изменений в стенках крупных артерий с последующей окклюзией просвета сосудов и ограничением кровоснабжения жизненно важных органов, таких, как сердце, головной мозг, почки. В медико-социальном аспекте атеросклероз является наиболее важной проблемой, поскольку его клинические проявления (так называемые атеросклеротические заболевания), в особенности инфаркт миокарда и острые нарушения мозгового кровообращения, занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности в экономически развитых странах. В настоящее время причины возникновения и механизмы развития атеросклероза изучены недостаточно. Эпидемиологические исследования выявили группу факторов, связанных с повышенным риском сосудистой окклюзии [1]. Факторы риска атеросклероза по своей сути являются клинико-биохимическими синдромами, способствующими развитию данной формы патологии. Воздействие на факторы риска с целью их устранения в настоящее время является наиболее изученным и широко используемым в клинической практике способом первичной профилактики атеросклероза. Такой подход можно рассматривать как непрямое воздействие, поскольку он основан на изменении внешних условий, способствующих или препятствующих возникновению и прогрессированию атеросклеротических поражений. В качестве внешних условий рассматриваются любые независимые клинико-биохимические факторы, существующие вне морфологического субстрата для атеросклеротических поражений, то есть не связанные напрямую с молекулярно-клеточными механизмами атерогенеза, действующими на уровне клеточных и неклеточных элементов интимального слоя артерий эластического и мышечно-эластического типа. Существует также представление о прямом антиатеросклеротическом воздействии, то есть о сугубо патогенетических подходах, которые предотвращают возникновение и прогрессирование атеросклеротических поражений на уровне молекулярно-клеточных механизмов атерогенеза в артериях человека, а в идеале - вызывает регрессию атеросклероза. Подходы к прямому антиатеросклеротическому воздействию находятся, по большей части, в стадии разработки. Прежде всего, это связано с отсутствием единой системы взглядов на патофизиологические процессы формирования атеросклеротических поражений.
Современные представления о клеточно-молекулярных механизмах атерогенеза основываются на ключевом положении липидной теории атеросклероза о том, что первым и ведущим признаком атеросклероза является накопление вне- и внутриклеточных липидов, главным образом свободного холестерина и его эфиров, в сосудистой стенке. Источником накапливающихся липидов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП). При этом для проявления атерогенного эффекта необходима какая-либо химическая модификация липопротеидных частиц, поскольку нативные (неповрежденные) ЛНП ни при каких условиях не вызывают накопления липидов в клетках артериальной стенки. Описаны многочисленные возможности подобной атерогенной модификации, оцененные в in vitro исследованиях, однако подавляющее большинство их не может играть какой-либо роли в процессах атерогенеза, поскольку не встречается в условиях in vivo. Это относится к металло-зависимому окислению, ацетилированию, малеилированию и многим другим видам химической модификации ЛНП. Круг возможных прижизненных атерогенных модификаций ЛНП резко сужен и фактически ограничен тремя вариантами: десиалированием, изменением суммарного поверхностного заряда и изменением гидратированной плотности липопротеидных частиц. Фактически, во всех трех случаях речь на самом деле идет об одном и том же типе множественной атерогенной модификации, оцененной и использованием разных способов лабораторной диагностики. При наличии в крови достаточного количества модифицированных ЛНП начинают действовать дополнительные механизмы, усиливающие их атерогенный потенциал. В первую очередь, речь идет о формировании крупных липидсодержащих комплексов. Известно, что модифицированные липопротеиды в силу изменения поверхностного заряда приобретают способность к спонтанной агрегации. Кроме того, модифицированные ЛНП приобретают антигенные свойства и индуцируют синтез аутоантител, что в конечном итоге приводит к формированию крупных ЛНП-содержащих иммунных комплексов. Модифицированные ЛНП также обладают повышенной авидностью к компонентам соединительнотканного матрикса. Все эти процессы вкупе приводят к появлению крупных ЛНП-содержащих частиц-агрегатов, метаболизм которых на клеточном уровне осуществляется альтернативными способами, отличными от классического рецепторного пути. Основным механизмом захвата таких частиц становится нерегулируемый фагоцитоз. Пути внутриклеточной деградации фагоцитированных ЛНП-содержащих частиц значительно отличаются от классического метаболизма нативных ЛНП, поэтому за короткое время происходит массивное внутриклеточное накопление остатков липопротеидных частиц, главным образом, в виде липидных капель. В гистологических исследованиях подобные клетки, называемые "пенистыми", являются непременным признаком атеросклеротического поражения.
С точки зрения изложенной концепции формирования ранних атеросклеротических поражений, становится ясно, что на молекулярно-клеточном уровне ключевым моментом в атерогенезе является накопление внутриклеточных липидов, обусловленное наличием модифицированных ЛНП. В этом случае патогенетический подход к профилактике и лечению атеросклероза определяется возможностью устранения физической причины патологии, а именно, предотвращению накопления внутриклеточных липидов. Существует ряд возможностей для воздействия на этот процесс, а именно: устранение модифицированных ЛНП из кровотока, подавление процессов модификации нативных ЛНП, активация внутриклеточного метаболизма липидов, подавление захвата модифицированных ЛНП клетками, удаление накопленных липидов из клеток. Интегральной оценкой эффективности различных антиатеросклеротических воздействий являются снижение скорости накопления внутриклеточных липидов и уменьшение внутриклеточного пула эфиров холестерина.
В настоящее время не существует лекарственных средств, в полной мере обладающих прямым антиатеросклеротическим действием. Известно, что регулярный прием различных препаратов может сказываться на процессах накопления холестерина в клетках артериальной стенки. Ряд лекарственных препаратов различных химических групп может способствовать снижению атерогенного потенциала сыворотки крови больных атеросклерозом. Понятие «атерогенный потенциал» («атерогенность») с точки зрения клеточной биологии означает способность сыворотки крови или ее компонентов вызывать накопление эфиров холестерина в клетках, культивируемых из непораженной атеросклерозом интимы аорты человека. Сыворотка крови здоровых лиц, в отличие от сыворотки крови больных атеросклерозом, не обладает атерогенными свойствами. Клеточный культуральный тест представляется наиболее оптимальным и адекватным способом моделирования ранних процессов атерогенеза на клеточном уровне. С использованием клеточного теста была предложена модель “ex vivo” для оценки антиатерогенного потенциала лекарств. Подобный подход сделал возможным проведение серийных испытаний, необходимых для потокового скрининга лекарственных средств, обладающих антиатерогенным эффектом, а также эпидемиологических и проспективных исследований, в которых, как правило, обследуются значительные контингенты больных. Была выявлена группа лекарственных средств, обладающих антиатерогенным действием, включающая антагонисты кальция, ингибиторы ГМГ-коэнзим А редуктазы, простациклины, ингибиторы липоксигеназы и др.
В настоящем исследовании были разработаны клеточные модели для поиска фармакологических веществ прямого патогенетического антиатеросклеротического действия, основанного на оттоке холестерина из клеток сосудистой стенки. Отток холестерина, являющийся составной частью механизма обратного транспорта холестерина в организме – это обратная сторона накопления холестерина в артериальных клетках. Именно накопление внутриклеточного холестерина и его отток определяют, произойдет ли ретенция (удержание) холестерина в сосудистой стенке. Стимуляция оттока холестерина не менее важна для устранения риска развития атеросклероза, чем предотвращение накопления внутриклеточного холестерина. На клеточном уровне отток холестерина – это проявление регрессии атеросклероза.

Материалы и методы

Первичная культура субэндотелиальных клеток аорты человека. Выделение и культивирование клеток производили из грудного отдела аорт мужчин и женщин в возрасте 40-65 лет в течение 1.5-3 часов после внезапной смерти. Причиной смерти в подавляющем большинстве случаев была острая сердечно-сосудистая недостаточность. Субэндотелиальные клетки выделяли из различных участков интимы аорты, различавшихся по степени атеросклеротического поражения, путем обработки коллагеназой и культивировали в соответствии с методом Орехова и соавторов [2-5]. Обработку аутопсийного материала проводили в стерильных условиях. После механического удаления адвентиции аорту рассекали вдоль и промывали в среде 199, содержащей по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина и 2,5 мкг/мл фунгизона. Из лоскута аорты вырезали участки, не пораженные атеросклерозом, а также участки, соответствующие жировой полосе или липофиброзной бляшке, в соответствии с классификацией Stary [6-8]. Затем с помощью пинцетов интиму отделяли от медии, при этом разделение слоев происходило по внутренней пограничной эластической мембране [4]. Полученный материал пинцетами разделяли на волокна. К измельченной интиме добавляли 0,15% раствор коллагеназы II типа (Worthington Diagnostic System, США) в среде 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Flow, Великобритания), 2 мМ L-глутамин, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2,5 мкг/мл фунгизона (все реактивы Grand Island Biological Company - GIBCO, США) из расчета 10 мл раствора фермента на 1 г сырой ткани. Инкубацию интимы с коллагеназой проводили на водяной бане при 37ºС с постоянным перемешиванием со скоростью 50 об/мин (Aquaterm, New Brunswick Scientific Company, США) до практически полного растворения ткани, что обычно занимало 2-3 часа. Эффективность растворения ткани оценивали визуально. Полученную суспензию клеток фильтровали через стерильную нейлоновую сетку и центрифугировали при 4ºС в течение 20 мин при 1800 g на низкоскоростной центрифуге (Beckman TJ-6, Beckman Division, США). Осажденные клетки промывали в 10 мл ростовой среды 199, содержащей антибиотики и 10% эмбриональную телячью сыворотку, и повторно центрифугировали при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в 10 мл ростовой среды и производили подсчет полученного количества клеток в счетной камере. Клетки рассаживали в пластиковый стерильный 96-гнездный микротест для тканевых культур (Nunclon, Дания) из расчета 2-4х104 клеток на 1 см2 культуральной поверхности. Клетки культивировали при 37ºС в насыщенной водяными парами атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа в увлажняемом СО2-инкубаторе (Forma Scientific, США). Смену среды проводили через день. Для экспериментов использовали 7-10-дневную первичную культуру клеток. Такая культура представляет собой смешанную клеточную популяцию, состоящую преимущественно из типичных и модифицированных гладкомышечных клеток [4, 9, 10]. Клетки, полученные из непораженных и атеросклеротических участков интимы аорты человека, культивировали раздельно и использовали в экспериментах различных типов, что позволяло в дальнейшем использовать две клеточных модели, различающихся по своим свойствам. Первичную культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для воспроизведения процессов атерогенеза на клеточном уровне и оценки антиатерогенных свойств исследуемых веществ. Антиатерогенным действием называли эффекты, препятствующие основным проявлениям атерогенеза на клеточном уровне, и, прежде всего, накоплению внутриклеточного холестерина. Первичную культуру клеток, выделенных из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для оценки антиатеросклеротических свойств исследуемых веществ. Антиатеросклеротическим действием называли эффекты, проявляющиеся в уменьшении содержания внутриклеточного холестерина по сравнению с исходным уровнем.

Культура моноцитов-макрофагов крови человека.      
Моноциты крови человека выделяли из крови здоровых добровольцев и культивировали до их созревания в макрофаги [11, 12]. Из локтевой вены здорового донора утром натощак брали 50 мл крови в стерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл стерильного 3,8% цитрата натрия в 0,15 М изотоническом фосфатном буфере (ФИБ) (рН=7,35). Кровь центрифугировали в течение 20 мин при 1800 g на центрифуге Beckman TJ-6. Плазму крови удаляли, а клеточный осадок, содержащий форменные элементы крови, доводили до первоначального объема стерильным ФИБ. В стерильную пластиковую пробирку вносили фиколл (Flow Labolatories, США) из расчета 0,5 мл на 1 мл полученной суспензии форменных элементов крови. На фиколл наслаивали суспензию форменных элементов крови и центрифугировали в течение 30 мин. при 1800 g. В стерильных условиях пипеткой с границы раздела плотности отбирали фракцию лейкоцитов. Полученные клетки ресуспендировали в 1 мл стерильного ИФБ, доводили стерильным ИФБ до 50 мл и центрифугировали в течение 15 мин при 1800 g. Последнюю процедуру отмывки клеток проводили трижды. Затем осадок лейкоцитов ресуспендировали в 1 мл среды 199 (GIBCO Europe, UK), содержащей 2 мM L-глютамина, 100 Ед/мл пенициллина, 2,5 мкг/мл фунгизона и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, USA). Количество полученных клеток подсчитывали под микроскопом Amplival (Carl Zeiss, Германия) в гемоцитометре. Клетки рассаживали в стерильные 48-луночные планшеты для клеточных культур (Nunc, Denmark) с плотностью 105 клеток на 1 см2 культуральной поверхности. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажности и 37ºС в течение 1 часа, после чего неприкрепившиеся клетки (грагулоциты) удаляли путем трехкратного промывания средой 199. К прикрепившимся клеткам (агранулоцитам) добавляли по 250 мкл среды 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики (преднизолон, стрептомицин и фунгизон), а также глютамин. Полученную чистую культуру моноцитов культивировали в СО2-инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажности и 37ºС в течение 14 суток до превращения их в макрофаги [13]. Смену инкубационной среды проводили каждые 48 часов. В экспериментах использовали культуру на 14-й день культивирования. Полученнyю таким образом культуру моноцитов-макрофагов крови человека использовали в клинических исследованиях при серийных измерениях атерогенных свойств сыворотки крови (ее способности вызывать накопление внутриклеточного холестерина).

Получение сыворотки крови.       
Кровь из локтевой вены в количестве 5-7 мл забирали стерильным одноразовым пластиковым шприцом в сухую пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл. Пробирку с кровью выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа для образования сгустка, затем в холодильнике при +4ºС в течение 1 часа для ретракции сгустка. Сгусток отделяли стеклянной палочной от стенок пробирки. Пробирку центрифугировали в настольной центрифуге Beckman TJ-6 при 1800 g в течение 15 мин. Полученную сыворотку крови (без примеси эритроцитов) разливали в пластиковые пробирки типа «Эппендорф» по 1 мл. Образцы сыворотки крови хранили в замороженном состоянии (при -18ºС) до проведения измерения атерогенности и других биохимических параметров.

Культивирование клеток с исследуемыми сыворотками крови человека.     
В день эксперимента культуральную среду заменяли на бессывороточную среду 199, содержащую по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, 2,5 мкг/мл фунгизона и 2 мМ L-глутамина, и к ней добавляли исследуемую сыворотку крови в конечной концентрации 40% (при использовании первичной культуры субэндотелиальных клеток непораженной интимы аорты человека) или 10% (при использовании культуры моноцитов-макрофагов крови человека). В качестве контроля использовали клетки, которые продолжали культивировать в среде 199, содержащей антибиотики и 10% эмбриональную телячью сыворотку, которая содержит необходимые факторы роста клеток, но не влияет на содержание внутриклеточных липидов [14]. Обычно из 88 гнезд с первичными культурами клеток, размещенных на одном 96-луночном микротесте для культур тканей, 16 использовали в качестве контроля, остальные – в качестве опытных культур, причем на испытание каждой сыворотки (или образца ЛНП) отводили по 4 культуры. При использовании 48-луночных микротестов в качестве контроля использовали 8 гнезд. По окончании инкубации культуры тщательно отмывали от культуральной среды дважды 0,15 М изотоническим фосфатным буфером (ФИБ) (рН=7,35), затем дважды ФИБ, содержащим 0,2% бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma Chemical Company, США), и еще трижды ФИБ.

Определение содержания внутриклеточного холестерина.     
По окончании инкубации липиды из клеток экстрагировали трижды смесью n-гексана и изопропанола в объемном отношении 3:2 по методу Hara и Radin [15], каждая экстракция продолжалась по 30 мин. Экстракт переносили в чистый 96-гнездный микротест и выпаривали при комнатной температуре под током воздуха. Полученный сухой осадок растворяли в 25 мкл раствора, содержащего 15 мМ холат натрия и 0,05% Тритон Х-100 (Sigma Chemical Company, США), добавляли по 25 мкл изопропанола и по 100 мкл раствора "Monotest" (Boehringer Mannheim, Германия) для определения общего холестерина. Ферментативный набор для определения общего холестерина содержал 0,2 ед/мл холестеринэстеразы, 0,1 ед/мл холестериноксидазы, 0,1 ед/мл пероксидазы хрена, 1 мМ 4-аминофеназона, 3 мМ фенола и 2 мМ 3,4-дихлорфенола в 50 мМ Трис-буфере, рН=7,7. В качестве стандарта использовали стандартный раствор холестерина в изопропаноле, 1 мг/мл (Boehringer Mannheim, Германия). Смесь инкубировали при 37ºС в течение 30 минут, после чего измеряли оптическую плотность проб при длине волны 492 нм на автоматическом 8-канальном спектрофотометре "Multiscan Bichromatic" (LabSystems, Финляндия) и рассчитывали содержание общего холестерина в каждой пробе. При необходимости, содержание свободного внутриклеточного холестерина определяли в аликвотах липидного экстракта аналогичным образом, используя раствор "Monotest" (Boehringer Mannheim, Германия) для определения свободного холестерина, не содержащий холестеринэстеразы. Содержание эстерифицированного внутриклеточного холестерина определяли по разнице уровней общего и свободного холестерина.

Определение внутриклеточных липидов методом тонкослойной хроматографии.             
Липиды из клеток экстрагировали трижды смесью n-гексана и изопропанола в объемном отношении 3:2 по методу Hara и Radin [15], каждая экстракция продолжалась по 30 мин. Нейтральные липиды разделяли методом тонкослойной хроматографии на силикагеле Kieselgel 60 (E. Merck, Германия) в двух последовательных системах: (а) бензол – диэтиловый эфир – этанол – уксусная кислота в объемном соотношении 50:40:2:0,2 и (б) n-гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота в объемном соотношении 90:10:1. В качестве стандартов использовали холестерилолеат, триолеин и холестерин. Фосфолипиды хроматографировали в системе метилацетат – n-пропанол – хлороформ – метанол – 0,25% KCl в объемном соотношении 25:25:25:10:9 (674). Сканирование хроматограммы проводили при длине волны 200 нм на сканнере Shimadzu CS-930 (Shimadzu Corporation, Япония).
Определение клеточного белка.   Фиксированные на пластике клетки после экстракции липидов растворяли в 50 мкл 0,2 н. NaOH при комнатной температуре в течение 12-16 часов, после чего определяли содержание клеточного белка в каждой пробе по методу Lowry et al. [16]. К пробе добавляли 200 мкл свежеприготовленного 0,2 н. раствора NaOH, содержащего 0,01% тартрата калия-натрия, 0,005% сульфата меди и 0,02% карбоната натрия, затем 20 мкл 1 н. реактива Фолина-Кукалту (Sigma Chemical Company, США) и выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего измеряли оптическую плотность проб на спектрофотометре "Multiscan Bichromatic" при длине волны 690 нм и рассчитывали содержание клеточного белка в каждой пробе. В качестве стандарта использовали раствор БСА в 0,2 н. NaOH (1 мг/мл).

Расчет атерогенного эффекта (оценка атерогенности сыворотки крови).             
Термином «атерогенность», или «атерогенный потенциал», обозначали способность сыворотки крови вызывать статистически достоверное накопление холестерина в культивируемых клетках. После определения содержания общего холестерина и белка вычисляли соотношение холестерин/белок в каждой пробе. Удельное содержание общего холестерина в клетках, выделенных из непораженных участков интимы аорты, колебалось в пределах 20-50 мкг/мг клеточного белка. Удельное содержание общего холестерина в моноцитах-макрофагах крови человека колебалось в пределах 8-20 мкг/мг клеточного белка. Среднее удельное содержание холестерина в контрольных клетках данной серии принималось за 100%, размах варьирования не превышал 8%. Атерогенный эффект исследуемых сывороток определяли по содержанию холестерина в опытных культурах и выражали в процентах от содержания внутриклеточного холестерина в контроле. Сыворотка крови пациента, вызывавшая статистически достоверное накопление внутриклеточного холестерина рассматривалась как атерогенная.

Оценка оттока холестерина (антиатеросклеротического эффекта) в модели in vitro.        
Для изучения антиатеросклеротического действия исследуемых веществ использовали первичную культуру субэндотелиальных клеток из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека. Удельное содержание общего холестерина в таких клетках обычно составляло 50-200 мкг/мг клеточного белка. В инкубационную среду добавляли исследуемое вещество в различных концентрациях. Обычно использовали логарифмический диапазон концентраций исследуемого вещества. Инкубацию, экстракцию липидов из клеток, определение клеточного белка и измерение удельного содержания общего холестерина проводили, как описано выше. Содержание внутриклеточного холестерина в контрольных клетках, инкубированных без добавления исследуемого вещества, принимали за 100%. Эффект на отток холестерина (антиатеросклеротический эффект) исследуемых веществ определяли как их способность статистически достоверно снижать исходно высокое содержание внутриклеточного холестерина.
Оценка оттока холестерина (антиатеросклеротического эффекта) в модели ex vivo. Исследования соответствовали требованиям, предъявляемым стандартом качественных клинических испытаний (Good Clinical Practice, GCP) к исследованиям фазы I и II. У добровольцев брали кровь непосредственно перед приемом исследуемого вещества, а также через соответствующие интервалы времени после его приема внутрь (обычно через 2, 4 и 6 часов при скрининговых исследованиях и при оценке краткосрочного действия, а также через 4, 8, 12 и 24 часа при оценке длительности эффекта). Инкубацию клеток из атеросклеротического поражения с сыворотками крови, экстракцию липидов из клеток и определение клеточного белка проводили, как описано выше. Эффект на отток холестерина (антиатеросклеротический эффект) исследуемых веществ в модели ex vivo определяли как их способность статистически достоверно снижать содержание холестерина в культивируемых атеросклеротических клетках. Существенной особенностью данной модели является возможность оценки антиатеросклеротического потенциала различных веществ (а также их активных метаболитов) после усвоения, распределения и биотрансформации в организме человека, то есть получение специфических фармакодинамических характеристик.

Определение пролиферативной активности.             
Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 10 мкКи/мл [3H]-тимидина. По окончании инкубации липиды из клеток экстрагировали, как описано выше, а фиксированные на пластике клетки растворяли в 50 мкл 0,2 н. NaOH при комнатной температуре в течение 12-16 часов. После растворения радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция).

Определение синтеза коллагена.     
Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 5 мкКи/мл [3H]-пролина. По окончании инкубации включение меченого пролина в обработанную коллагеназой фракцию культуральной среды определяли по методу Peterkofsky и Diegelmann [16]. Из культуры отбирали 500 мкл среды и переносили в стеклянные пробирки. Клетки промывали 2 раза по 250 мкл ФИБ и смывы переносили в те же пробирки. Пробы нагревали в течение 15 мин при 80ºС для инактивации протеиназ. После охлаждения до +4ºС в пробы добавляли 1 мл 20% ледяной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), содержащей 2 мМ пролина. Спустя 10 мин пробы центрифугировали (10 мин, 3500 g). Супернатант отбрасывали, а осадок промывали трижды 1 мл 5% ТХУ, содержащей 1 мМ пролина. Промытый осадок растворяли в 0,4 мл 0,1 N NaOH, разделяли на аликвоты по 200 мкл и нейтрализовали равным объемом 0,08 N HCl. К одной из аликвот добавляли 80 мкл 60 mM HEPES, содержащего 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,25 мМ CaCl2, 1,25 мМ N-этиленамида, и 20 мкл раствора коллагеназы (1 мг/мл) (Worthington Diagnostic System, США). К другой аликвоте, служившей бланком, добавляли те же вещества за исключением коллагеназы. Пробы инкубировали 4 часа при 37ºС. Инкубацию останавливали добавлением 0,5 мл 10% ТХУ, содержащей 0,5% таниновой кислоты. После центрифугирования в течение 10 мин при 1800 g определяли радиоактивность супернатанта на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция). Синтез коллагена определяли по формуле 2*([dpm]образца – [dpm]бланка)/(клеточный белок, мкг).

Статистическая обработка данных.        
Статистическую оценку достоверности различий проводили с использованием пакета SPSS версии 12.0 (SPSS Inc., США). Графическую обработку данных проводили с использованием пакета SigmaPlot версии 7.0 (SPSS Inc., США). Достоверными считали различия при 95% вероятности безошибочного прогноза. Характер распределения признака определяли с помощью F-теста и теста Колмогорова-Смирнова. После оценки вариабельности признака в отношении нормальности распределения для межгрупповых сравнений использовали тест Манна-Уитни или групповой t-тест, для оценки изменений показателей в динамике использовали тест Уилкоксона или парный t-тест. Для сравнения распределений номинальных показателей и категорийных величин использовали показатель хи-квадрат по Пирсону с поправкой по Йетсу. Для оценки связи клинико-биохимических показателей и их изменений использовали корреляционный анализ по Пирсону с поправкой Бонферрони и регрессионный анализ. В окончательном виде данные для непрерывных величин представляли в виде среднего арифметического значения с указанием стандартной ошибки.
 

Результаты

Разработка и создание клеточной модели ин витро для поиска фармакологических веществ, потенциально пригодных для ЛВП-терапии. В качестве основы для клеточной модели ин витро были выбраны первичные культуры макрофагов, полученные из моноцитов, выделенных из крови человека. Для дифференцировки моноцитов в макрофаги клетки сажали на 24-луночные планшеты и обработали 100 нМ форбол-12-миристат-13-ацетатом в течение 72 ч до начала эксперимента. Макрофагов нагружали липидами путем инкубации их в присутствии 25 мкг белка на лунку ацетилированных ЛНП. Жизнеспособность и степень прикрепления клеток оценивали с помощью световой микроскопии и измерения белка. Цитотоксических эффектов не было выявлено. Среду в культуре меняли каждые 2-3 дней. После 7 дней в культуре, когда моноциты полностью дифференцировались в макрофаги, они были использованы в методике, модификацированной ранее. Суть модификации заключалась в определении оттока холестерина высокочувствительным методом определения холестерина в культивируемых клетках до и после инкубации с исследуемым агентом вместо радиоизотопного анализа оттока холестерина. Для максимального приближения эксперимента к реальным условиям в организме была разработана методика культивирования клеток, выделенных из аутопсийного материала аорты человека. Клетки выделяли из субэндотелиального слоя интимы, поскольку именно в этом слое возникает и развивается атеросклеротическое поражение. Клетки выделяли из жировых атеросклеротических поражений. Такие клетки сохраняют в культуре избыточное содержание холестерина, являющееся основным проявлением атеросклероза на клеточном уровне. Использование этого подхода не предусматривает искусственной нагрузки культивируемых клеток холестерином. Состав и содержание внутриклеточных липидов полностью соответствуют составу и содержанию липидов в клетках, популирующих атеросклеротическое поражение сосудистой стенки человека. Методика выделения и культивирования субэндотелиальных клеток интимы аорты человека описана в разделе «Методы». С целью расширения показателей антиатеросклеротической активности помимо содержания внутриклеточного холестерина определяли содержание других классов липидов, а также влияние исследуемых агентов на пролиферативную активности культивируемых клеток, а также на синтез коллагена. Повышенная пролиферативная активность и усиленный синтез компонентов внеклеточного матрикса, прежде всего коллагена, являются, наряду с накоплением внутриклеточного холестерина, наиболее яркими проявлениями атеросклероза на клеточном уровне. Пролиферативную активность оценивали по включению меченого тимидина в ядра культивируемых клеток, а синтез коллагена по включению меченого пролина. Методика оценки пролиферативной активности и синтеза коллагена культивируемыми клетками интимы аорты человека описана в разделе «Методы». Разработка и создание клеточной модели экс для поиска фармакологических веществ, потенциально пригодных для ЛВП-терапии       В качестве основы для разработки методики экс виво для изучения оттока холестерина из культивируемых макрофагов была использована методика, разработанная для варианта ин витро (см. выше). Существенным отличием от нее было то, что в культуру клеток добавляли не агента (фармакологические вещества), а сыворотку крови больных, принимавших различные препараты. Оценивалось влияние препарата на отток холестерина. Данная модель максимально приближена к ситуации в организме, что легко интерпретировать результаты, полученные на этой модели. Поскольку в сыворотке содержатся все компоненты, которые могут влиять на отток холестерина, получаемые данные следует рассматривать как интегральный показатель, отражающий конечный результат влияния всех возможных эффекторов на отток холестерина.
Испытание фармакологических веществ на разработанных моделях. Разработанная клеточная модель в варианте ин витро была использована для оценки влияния на отток холестерина гиполипидемических препаратов, используемых для снижения уровня холестерина в крови, относящихся к различным классам фармакологических веществ. Среди них был ловастатин, относящийся к классу статинов, а также липостабил, содержащий липиды натурального происхождения. Были также испытаны ингибиторы ацил-КоА-холестерина-ацилтрансфераза (АХАТ) – фермента, принимающего участие в накоплении холестерина в клетках сосудистой стенки. Было обнаружено, что только липостабил достоверно снижал содержание холестерина в клетках, культивируемых из атеросклеротических поражений аорты человека, то есть вызывал обратный транспорт холестерина (Таблица 1). Ни статин, ни ингибиторы АХАТ не способствовали обратному транспорту холестерина из атеросклеротических клеток. Полученные данные являются ярким примером того, что снижение холестерина в крови не обязательно сопровождается снижением холестерина в сосудистой стенке. Так, сильное гиполипидемическое лекарственное средство ловастатин, снижающее уровень холестерина в крови путем подавления его синтеза, не способствовал обратному транспорту холестерина из атеросклеротических клеток. С другой стороны, липостабил, обладающий умеренным гиполипидемическим действием, обладал выраженным эффектом на отток холестерина. Экстраполируя этот эффект липостабила на ситуацию в организме, можно предполагать, что липостабил обладает антиатеросклеротическим действием, вызывая регрессию атеросклеротического поражения в сосуде.
 
Таблица 1 - Влияние липостабила, ловастатина и ингибиторов ацил-КоА-холестерина-ацилтрансферазы (АХАТ) на содержание холестерина в атеросклеротических клетках интимы аорты человека in vitro
 

 
Примечания
Клетки из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека выделяли и культивировали, как описано в разделе «Методы». Влияние веществ на содержание внутриклеточного холестерина изучали в концентрации 10-6M. Данные представляют средние значения, полученные в трех независимых экспериментах;
* - достоверное снижение содержания внутриклеточного холестерина, p<0,05.
 
Неожиданным оказалось отсутствие эффекта у ингибиторов АХАТ. Эти соединения прямо участвуют во внутриклеточном метаболизме холестерина, препятствуя этерификации свободного холестерина и, тем самым, обеспечивая накопление холестерина в клетках в форме эфиров холестерина. Тем не менее, ингибиторы АХАТ не способствовали снижению холестерина в атеросклеротических клетках, то есть не повышали обратный транспорт холестерина. Можно предполагать, что эти соединения в лучшем случае обладают антиатерогенным эффектом, то есть препятствуют возникновению и развитию атеросклеротического поражения, но не антиатеросклеротическим эффектом, проявляющемся в регрессии уже имеющихся атеросклеротических поражений.
В Таблице 2 приведены данные комплексной оценки влияния на атеросклеротические показатели культивируемых клеток известного лекарственного средства верапамила, относящегося к классу антагонистов кальция. Известно, что верапамил обладает антиатеросклеротическим действием, вызывая регрессию атеросклероза у больных с документированными атеросклеротическими поражениями сосудов [18]. В первичной культуре интимальных клеток аорты человека верапамил дозозависимо снижал содержание общего холестерина, то есть способствовал обратному транспорту холестерина. В отсутствие верапамила отток холестерина из клеток не наблюдался. При этом свободный (неэтерифицированный) холестерин не изменялся. Это свидетельствует о том, что снижение содержания холестерина в клетках происходит исключительно за счет эфиров холестерина. Наряду со снижением общего холестерина наблюдалось уменьшение содержания двух других важнейших классов внутриклеточных липидов – фосфолипидов и триглицеридов. Таким образом, обратный транспорт холестерина из атеросклеротических клеток сопровождается снижением внутриклеточного содержания других важнейших классов липидов, что должно способствовать освобождению клеток атеросклеротического поражения от избыточного жира. Такая регрессия клеточного липидоза может объяснять механизм антиатеросклеротического действия верапамила.
 
Таблица 2 - Антиатеросклеротические эффекты верапамила в модели in vitro
 

 
Примечания
- Контрольные уровни в контроле составили 12,2±0,2 dpm/мкг клеточного белка для включения меченого тимидина; 57,4±1,2, 71,4±10,9, 46,8±5,3, 12,1±1,7 30,8±1,6 мкг/105 клеток для общего холестерина, фосфолипидов, свободного холестерина, триглицеридов и эфиров холестерина, соответственно; 2500±102 dpm/103 клеток для включения меченого пролина.
- Достоверность отличий от контроля указана в таблице.
           
Верапамил вызывал дозозависимое существенное подавление пролиферативной активности культивируемых атеросклеротических клеток (Таблица 2). Кроме того, верапамил подавлял синтез коллагена в первичной культуре клеток, выделенных из атеросклеротического поражения (Таблица 2).
            Таким образом, верапамил не только способствует оттоку холестерина из атеросклеротических клеток, но обладает и другими антиатеросклеротическими эффектами на уровне клеток сосудистой стенки, подавляя пролиферативную и синтетическую активность, то есть уменьшает или подавляет все основные проявления атеросклероза на клеточном уровне – липоидоз, пролиферацию и фиброз. Полученные данные демонстрируют важное свойство разработанной модели для оценки оттока холестерина. Она сможет быть использована для оценки антиатеросклеротической активности в целом и для изучения механизма антиатеросклеротических эффектов различных агентов.
Влияние верапамила на отток холестерина, выявленный на модели in vitro, был подтвержден на модели ex vivo. В Таблице 3 приведены данные, полученные на разработанной модели ex vivo. Добровольцы однократно принимали верапамил в дозе 40 мг. Кровь брали до приема верапамила (время «0») и через 1 час, 2 часа, 4 часа  и 8 часов после приема. Из образцов крови готовили сыворотку, и образцы сыворотки добавляли в первичную культуру атеросклеротических клеток. Можно видеть, что значимое снижение содержания внутриклеточного холестерина наблюдалось в случае добавления в культуру сыворотки, приготовленной из крови, взятой спустя 2 часа после однократного приема верапамила (Таблица 3). Таким же эффектом обладали сыворотки, взятые через 4, 8 и 12 часов после приема верапамила. Следовательно, начиная с 2 часов после однократного приема верапамила сыворотка крови приобретает антиатеросклеротические свойства, проявляющиеся в способствовании обратному оттоку холестерина из атеросклеротических клеток. Антиатеросклеротический свойства сыворотки сохраняются, по крайней мере, в течение 12 часов после приема. На разработанных клеточных моделях оттока холестерина  в вариантах in vitro и ex vivo были испытаны различные фармакологические вещества. На модели in vitro сравнивали описанные выше эффекты верапамила с эффектами других лекарственных средств.
 
Таблица 3 - Антиатеросклеротическое действие верапамила в модели ex vivo
 

 
Примечания
Контрольные клетки, выделенные из атеросклеротического поражения, содержали 221±13 мкг холестерина на 1 мг клеточного белка; этот уровень принят за 100%;
* - достоверное снижение уровня внутриклеточного холестерина, p<0,05.


Верапамил, будучи представителем класса антагонистов кальция, является антиангинальным препаратом. Антиангинальные лекарственные средства широко применяются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, морфологической основой которых является атеросклероз. Данные о прямых антиатеросклеротических эффектах верапамила на уровне артериальных клеток, выявленные на модели ин витро, стали побудительным мотивом для проверки других классов антиангинальных лекарственных средств на этой модели. В дополнение к верапамилу, были испытаны другие антагонисты кальция, в частности: нифедипин, дилтиазем, никардипин, циннаризин, папаверин. Кроме того, на разработанной клеточной модели in vitro  были испытаны бета-блокаторы и нитраты, которые, наряду с антагонистами кальция, являются наиболее широко используемыми классами антиангинальных препаратов. Среди бета-блокаторов использовались: пропранолол, альпренолол, метопролол, пиндолол, тимолол. Нитратами, подвергнутыми испытаниям на модели in vitro,  были: нитроглицерин, изосорбид, нитропруссид.
            Все исследованные антагонисты кальция способствовали оттоку холестерина из атеросклеротических клеток на разработанной клеточной модели in vitro, вызывая значимое снижение содержания внутриклеточного холестерина в культивируемых клетках атеросклеротического поражения аорты человека (Таблица 4). Помимо этого, все антагонисты кальция подавляли пролиферативную активность атеросклеротических клеток (Таблица 4). Таким образом, можно утверждать о наличии у антагонистов кальция антиатеросклеротических эффектов, проявляемых на уровне клеток сосудистой стенки.
            Напротив, все исследованные бета-блокаторы не только не способствовали оттоку холестерина из атеросклеротических клеток на разработанной модели in vitro, но и повышали в них содержание холестерина (Таблица 4). Параллельно все бета-блокаторы  стимулировали пролиферативную активность культивируемых атеросклеротических клеток (Таблица 4). Таким образом, в противоположность антиатеросклеротическим эффектам антагонистов кальция, бета-блокаторы вызывают прямые проатерогенные эффекты на уровне артериальных клеток.
            Третий класс антиангинальных препаратов – нитраты – не способствовал оттоку холестерина на модели in vitro. Нитраты не оказывали значимого влияния ни на содержание холестерина, ни на пролиферативную активность атеросклеротических клеток, то есть они не обладали эффектами, имеющими отношение к атеросклерозу (Таблица 4). Данные проведенных исследований яркой иллюстрацией использования разработанной клеточной модели оттока холестерина in vitro для выявления эффективности различных фармакологических средств.
 
Таблица 4 - Влияние антагонистов кальция, бета-блокаторов и нитратов на содержание холестерина и пролиферативную активность клеток, выделенных из атеросклеротической бляшки
 

Примечания
1 * - достоверное снижение показателей по сравнению с контролем, p<0,05;
2 # - достоверное повышение по сравнению с контролем, p<0,05.
 
При этом данные о прямых антиатеросклеротических эффектах антагонистов кальция, проатерогенных эффектах бета-блокаторов и выявленное отсутствие эффектов, имеющих отношение к атеросклерозу, у нитратов имеют важное самостоятельное значение для объяснения механизмов различного действия этих препаратов на развитие атеросклероза в артериальной стенке [19].
 

Обсуждение        

В данном исследовании были применены клеточные модели, разработанные на основе первичной культуры клеток интимы аорты человека. Первичную культуру клеток, выделенных из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для оценки антиатеросклеротических свойств исследуемых веществ. Антиатеросклеротическим действием называли эффекты, проявляющиеся в уменьшении содержания внутриклеточного холестерина по сравнению с исходным уровнем. Снижение содержания холестерина в атеросклеротических клетках является интегральным показателем оттока холестерина. На основе первичной культуры клеток, культивируемых из непораженной атеросклерозом интимы аорты человека, была разработана и применена модель ex vivo, заключающаяся в оценке изменений атерогенных свойств сыворотки крови под воздействием приема различных лекарственных средств. Существенной особенностью данной модели является возможность оценки антиатерогенного потенциала различных веществ (а также их активных метаболитов) после усвоения, распределения и биотрансформации в организме человека, то есть получение специфических фармакодинамических характеристик.
С помощью данных моделей была оценена распространенность такого явления, как атерогенность сыворотки крови, то есть ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках и, таким образом, воспроизводить первичный акт атерогенеза на клеточном уровне. Была оценена антиатерогенная и антиатеросклеротическая активность различных лекарственных средств и компонентов натурального происхождения в экспериментах in vitro и в модели ex vivo. Было продемонстрировано, что антиатеросклеротическое и антиатерогенное действие свойственно таким классам лекарственных средств, как ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы (статины) и антагонисты кальция. Тем не менее, возможность их широкого применения в качестве средств антиатеросклеротической терапии является весьма ограниченной из-за наличия строгих показаний к назначению, противопоказаний и возможности развития побочных эффектов и явлений. С учетом массовой распространенности субклинического атеросклероза, стояла задача разработки нелекарственных подходов к антиатерогенной и антиатеросклеротической терапии, основанной на подавлении процессов внутриклеточного накопления холестерина в сосудистой стенке. В клеточных моделях in vitro и ex vivo был проведен скрининг биологически активных веществ натурального происхождения и растительных препаратов. В результате была идентифицирована группа натуральных продуктов, обладающая выраженным антиатерогенным действием в модели ex vivo. Из выявленных растений, обладающих антиатерогенным действием, внимание привлек чеснок (Allium sativum). В научной литературе было опубликовано большое количество результатов исследования кардиопротективного действия чеснока и препаратов на его основе. Известно, что чеснок оказывает влияние на ряд факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний: снижает уровень холестерина в плазме крови, снижает артериальное давление, подавляет агрегационную способность тромбоцитов и повышает фибринолитическую активность плазмы крови [20, 21].
            На пути разработки антиатеросклеротических лекарственных средств прямого действия важную роль может сыграть ЛВП-терапия. Эпидемиологические и клинические исследования предоставили доказательства того, что низкий уровень ЛВП является основным фактором риска развития ишемической болезни сердца. Способность ЛВП препятствовать развитию атеросклеротических поражений коронарных артерий была убедительно документирована и, хотя точные механизмы неизвестны, защитный эффект ЛВП связывают с их ролью в обратном транспорте холестерина. Данные эпидемиологических исследований указывают на возможность применения ЛВП-терапии для снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний, однако, это еще не доказано непосредственно.
            Тенденции последних 3-5 лет ясно указывают на повышенный интерес фармацевтических компаний к ЛВП-терапии как к дополнению или альтернативе снижения уровня холестерина в крови. Это имеет простое объяснение. Интенсивные разработки  гиполипидемических лекарственных средств в течение последних 15-20 лет привели к появлению высокоэффективных лекарств, способных блокировать синтез холестерина в организме. Дальнейшее развитие в этом направлении бесперспективно, поскольку достигнуты максимально возможные эффекты подавления синтеза холестерина. Именно поэтому ЛВП-терапия, являющаяся обратной стороной гиполипидемической терапии, становится наиболее обещающим направлением развития фармацевтики в области сердечно-сосудистых заболеваний.
На клеточном уровне антиатеросклеротические эффекты ЛВП-терапии проявляются, прежде всего, в оттоке холестерина. Нами разработаны наиболее приближенные к ситуации в организме клеточные модели, позволяющие оценивать отток холестерина как интегральный показатель важнейшего проявления обратного транспорта холестерина. Полученные данные позволяют с оптимизмом рассматривать возможность применения разработанных моделей для создания новых антиатеросклеротических лекарственных средств и для изучения механизмов их действия.
 
Литература:
 
1. Anderson, K.M., Wilson, P.W., Odell, P.M., Kannel, W.B. An updated coronary risk profile. A statement for health professionals. // Circulation. - 1991. - Vol. 83 - P.356-362.
2. Orekhov, A.N., Andreeva, E.R., Krushinsky, A.V., Smirnov, V.N. Primary cultures of enzyme-isolated cells from normal and atherosclerotic human aorta. // Med. Biol. - 1984. - Vol. 62 - P. 255-259.
3. Orekhov, A.N., Karpova, I.I., Tertov, V.V., et al. Cellular composition of atherosclerotic and uninvolved human aortic subendothelial intima. Light-microscopic study of dissociated aortic cells. // Am. J. Pathol. - 1984. - Vol. 115 - P. 17-24.
4. Orekhov, A.N., Tertov, V.V., Novikov, I.D., et al. Lipids in cells of atherosclerotic and uninvolved human aorta. I. Lipid composition of aortic tissue and enzyme-isolated and cultured cells. // Exp. Mol. Pathol. - 1985. - Vol. 42 - P. 117-137.
5. Tertov, V.V., Orekhov, A.N., Ryong, L.H., Smirnov, V.N. Intracellular cholesterol accumulation is accompanied by enhanced proliferative activity of human aortic intimal cells. // Tissue. Cell. - 1988. - Vol. 20 - P. 849-854.
6. Stary, H.C. Natural History and Histological Classification of Atherosclerotic Lesions : An Update. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2000. - Vol. 20 - P. 1177-1178.
7. Stary, H.C. Composition and classification of human atherosclerotic lesions. // Virchows. Arch. (A). - 1992. - Vol. 421 - P. 277-290.
8. Stary, H.C., Chandler, A.B., Glagov, S., et al. A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. // Circulation. - 1994. - Vol. 89 - P. 2462-2478.
9. Андреева, Е.Р., Михайлова, И.А., Пугач, И.М., Орехов, А.Н. Клеточный состав атеросклеротических поражений аорты человека. // Ангиол. Сосуд. Хир. – 1999. – Т. 5 – С. 6-26.
10. Андреева, Е.Р., Тертов, В.В., Мухин, Д.Н., Орехов, А.Н. Клеточный состав и биохимические особенности аорты человека. // Бюлл. ВКНЦ. АМН. СССР. – 1985. – Т. 8 – С. 63-71.
11. Adams, D.O. Macrophages. // Methods Enzymol. - 1979. - Vol. 58 pp. 494-505.
12. Edelson, P.J., Kohn, Z.A. Purification and Cultivation of Monocytes and Macrophages. // In: In vitro methods in cell-mediated and tumor Immunity. Bloom, B.R., David, J.R., eds. Academic Press, Inc., New York. - 1976. - P. 333-340.
13. Virella, G., Mudoz, J.F., Galbraith, G.M.P., et al. Activation of human monocyte-derived macrophages by immune complexes containing low-density lipoprotein. // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1995. - Vol. 75 - P. 179-189.
14. Orekhov, A.N., Tertov, V.V., Smirnov, V.N. Lipids in cells of atherosclerotic and uninvolved human aorta. II. Lipid metabolism in primary culture. // Exp. Mol. Pathol. - 1985. - Vol. 43 - P. 187-195.
15. Hara, A., Radin N.S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. // Anal. Biochem. - 1978. - Vol. 90 - P. 420-426.
16. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, B.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193 - P. 265-275.
17. Peterkofsky, B., Diegelmann, R. Use of mixture of proteinase free collagenases  for specific assay of radioactive collagen  in  the presence of other protiens. // Biochemistry. - 1971. - Vol. 10 - P. 988-984.
18. Hernández, R.H., Armas-Hernández, M.J., Velasco, M., et al. Calcium antagonists and atherosclerosis protection in hypertension. // Am. J. Ther. 2003. - Vol. 10 - P. 409-414.
19. Loaldi, A., Polese, A., Montorsi, P., et al. Comparison of nifedipine, propranolol and isosorbide dinitrate on angiographic progression and regression of coronary arterial narrowings in angina pectoris. Am J Cardiol. 1989. - Vol. 64 - P. 433-439.
21. Ackermann, R.T., Mulrow, C.D., Ramirez, G., et al. Garlic shows promise for improving some cardiovascular risk factors. // Arch. Intern. Med. - 2001. - Vol. 161 - P. 813-824.
20. Agarwal, K.C. Therapeutic actions of garlic constituents. // Med. Res. Rev. - 2003. - Vol. 16 - P. 111-124.
 
Работа была поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации.