Сазонова МА, Иванова ММ, Желанкин АВ, Митрофанов КЮ, Коробов ГА, Мясоедова ВА, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Постнов АЮ, Орехов АН.
Проблемы и перспективы современной науки 2011 3(1): 105-107

Резюме

Проведена детекция митохондриальной делеции гуанина в позиции 652 при атеросклеротических поражениях человека. Полученные результаты показывают определенные различия в проценте гетероплазмии 652delG  между здоровыми людьми и пациентами с атеросклеротическими поражениями.
Пороговый уровень гетероплазмии мутации митохондриального генома  652delG, равный 9%,  может служить прогностическим признаком атеросклероза сонных артерий у человека. 
     

Введение

Одной из актуальных проблем современной медицины является выяснение молекулярно-генетических основ развития атеросклероза, лежащего в основе большинства сердечно-сосудистых заболеваний. Данные заболевания «лидируют» среди причин смерти людей на нашей планете, обуславливая общепопуляционное снижение продолжительности жизни. По данным ВОЗ, продолжительность жизни людей приблизительно на 50% определяется наличием заболеваний органов кровообращения.  Например, в США в 1987 году  46% смертельных случаев произошло из-за сердечно-сосудистых заболеваний. Обращает на себя внимание то, что в подавляющем большинстве этих случаев был обнаружен атеросклероз  [1].
У половины больных отмечается отягощенная наследственность, являющаяся фактором риска развития  атеросклероза, сердечно-сосудистых заболеваний, ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда, поэтому большое значение имеет ранняя диагностика и своевременная профилактика атеросклероза. Как правило, пациенты обращаются к врачу на том этапе, когда течение болезни сопровождается яркими клиническими проявлениями и осложнениями. При этом основная причина патологического процесса остается невыясненной и, со временем, приводит к необратимым изменениям тканей и органов [2,3].
Исследования генома человека делают возможным раннюю, досимптоматическую диагностику атеросклероза. Эта цель может быть достигнута путем молекулярного тестирования генов, получивших название “генов предрасположенности”. Мутации данных генов совместимы с жизнью, но в сочетании с неблагоприятными факторами внешней среды (инфекциями, лекарствами, продуктами питания, экологическими загрязнениями) могут быть причиной заболеваний, таких как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца,  инфаркт миокарда и т.д. [4].        
Следует отметить, что в патологии человека показана ассоциация различных заболеваний с мутациями митохондриального генома. Митохондриальные мутации ассоциируются с различными заболеваниями, часто встречающимися в сочетании с атеросклеротическими поражениями, такими как стеноз коронарных сосудов, некоторые формы диабета и глухоты, инфаркт миокарда, кардиомиопатия [5-10] . 
В каждой митохондрии содержится несколько копий ее генома. Митохондриальный геном наследуется по материнскому типу и отличается выраженной нестабильностью, в нем часто возникают мутации. Пенетрантность и экспрессивность таких мутаций варьируют в широких пределах от семьи к семье и между родственниками (по материнской линии) одной семьи и зависят, главным образом, от генотипа и уровня гетероплазмии (смесь мутантных и нормальных молекул ДНК). Поэтому при изучении ассоциации митохондриальных мутаций с заболеваниями людей необходима не только качественная (наличие/отсутствие мутации), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии).
В настоящей работе проведен молекулярный анализ мутации 652delG  митохондриального генома человека в образцах ДНК из лейкоцитов крови пациентов, больных атеросклерозом и здоровых доноров. Мутация локализована в кодирующей области митохондриального генома, в частности, в гене рРНК 12S. Данная мутация вызывает дефект малой субъединицы рибосомальной РНК, вследствие чего нарушается синтез митохондриальных белков.
 

Материалы и методы

Материалом для данного исследования служили образцы лейкоцитов крови 190 пациентов (84 мужчин в возрасте старше 30 лет, средний возраст 63,9 (SD=10,2) лет, и 106 женщин в возрасте старше 46 лет, средний возраст 65,8 (SD=8,6) лет).       
Образцы крови были взяты у пациентов, входящих в группу риска: страдающие одним из заболеваний, наиболее часто ассоциированных с атеросклерозом (артериальной гипертонией, сахарным диабетом 2 типа, ишемической болезнью сердца, острым инфарктом миокарда, бронхиальной астмой, нарушением мозгового кровоснабжения) или здоровых мужчин старше 40 лет и женщин старше 50 лет.
Для прижизненной диагностики атеросклероза использовали ультрасонографию высокого разрешения в В-режиме с использованием линейного сосудистого датчика с частотой 7,5 МГц с последующей компьютерной оценкой толщины интимо-медиального слоя (ТИМС) общих сонных артерий.
При определении степени предрасположенности к атеросклерозу использовали пограничные возрастно-половые значения показателя ТИМС. Абсолютные значения показателя ТИМС были перекодированы в квартильные показатели ординарной шкалы (1, 2, 3 или 4) в соответствии с величинами межквартильных границ. При этом, независимо от пола и возрастной группы, принадлежность к 1-й квартили рассматривали как признак низкой предрасположенности к атеросклерозу, принадлежность к 4-й квартили – как признак высокой предрасположенности к атеросклерозу. Принадлежность ко 2-й и 3-й квартилям рассматривали как соответствие возрастной норме.
При ультразвуковом обследовании также оценивали наличие атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий с использованием ординарной (балльной) шкалы: (0) отсутствие атеросклеротических бляшек; (1) наличие гемодинамически незначимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда до 20%; (2) наличие условно гемодинамически незначимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда от 20% до 50%; (3) наличие гемодинамически значимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда более 50%.
В обследованной выборке 83 человека (44%) не имели атеросклеротических бляшек в бассейне общих сонных артерий, 61 человек (32%) имели бляшки 1-й степени, 46 человек (24%) имели бляшки 2-3 степени. По толщине интимо-медиального слоя общих сонных артерий 49 человек (1-я квартиль) были идентифицированы как не предрасположенные к атеросклерозу, 44 человека (4-я квартиль) – как предрасположенные к атеросклерозу, 97 человек (2-3 квартили) – как имеющие возрастную норму.
     
Выделение ДНК 
Выделение тотальной ДНК из образцов различных тканей (5-10 мг) или крови (5мл) проводилось с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Визуализацию результатов выделения ДНК проводили  с помощью электрофореза  в горизонтальном аппарате в 0,8% агарозном геле.
 
ПЦР
При амплификации фрагмента размером 467 п.н., содержащего область мутации 652insG, использовали следующие праймеры:
1.Прямой праймер TAGACGGGCTCACATCAC    (621 - 638);
2.Обратный праймер bio-GGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGT (1087 -  1064).
Обратный праймер был биотинилирован в целях дальнейшего пиросеквенирования ПЦР-фрагмента.
Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 0,4 - 0,6 мкг митохондриальной ДНК; 16,6 мкМ (NH4)2SO4; 0,3 пикомоль каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 67 мМ трис/HCl ( pH 8,8 ), 2,5 mM MgCL2  и 3 ед. Taq-полимеразы.
Режим ПЦР: денатурация ДНК при 940 C в течение 3–х минут, затем:
940 C – 45 сек., 600 C –45 сек., 720 C –1 мин., всего – 35 циклов, с заключительным синтезом при 720 C  в течение 7 мин.
Детекцию продуктов ПЦР проводили  с помощью электрофореза  в горизонтальном аппарате в 1,5% агарозном геле.
 
Пиросеквенирование 
После проведения ПЦР амплификаты были пиросеквенированы для выявления инсерции G в гене субъединицы 12S в позиции 652 митохондриального генома человека. Исследования проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQTMHS96MA. При постановке эксперимента была использована схема приготовления проб, описанная в прилагающемся к пиросеквенатору методическом пособии.
Последовательность праймера для сиквенса была следующей:
CCCATAAACAAATA  (639 - 651).
Визуализация результатов осуществлялась с помощью программы, прилагающейся при установке пиросеквенатора.
 
Статистическая обработка
Статистическую обработку данных проводили при помощи статистического пакета SPSS 14.0 (SPSS Inc., США). Данные представляли в виде среднего значения с указанием стандартного отклонения.
Генетическая диагностика атеросклероза с помощью детекции 652delG
Диагностика пациентов на предрасположенность к атеросклерозу проводилась следующим образом:
a) тестировались образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов  крови пациентов, на наличие мутации  652delG;
б) проводился расчет процента гетероплазмии мутации 652delG в данных образцах;
в) на основании полученных данных по молекулярно-генетической  диагностике и ультрасонографическому обследованию делался вывод о том, имеется ли у пациента предрасположенность к возникновению и развитию атеросклеротических поражений.
 

Результаты и обсуждение

Для количественной оценки мутантного аллеля, содержащего делецию G в позиции 652 митохондриального генома человека, мы использовали метод пиросеквенирования в нашей модификации. Метод пиросеквенирования основан на измерении вспышки, возникающей при взаимодействии АТФ с люциферином. Данная реакция катализируется ферментом люциферазой. Следует отметить, что АТФ образуется из пирофосфата, с помощью фермента сульфаразы. Пирофосфат (давший название всему методу пиросиквенса), в свою очередь, выделяется при взаимодействии нуклеотида, комплементарного нуклеотиду исследуемого биотинилированного одноцепочечного участка, с сиквенсовым праймером или очередным соседним нуклеотидом, которые уже встроены в комплементарную цепь [11-16].
Благодаря разработанному авторами статьи методу возможна не только качественная  (есть мутация или ее нет), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии) в биологических образцах.
Для подсчета процента гетероплазмии используется ранее  разработанная авторами формула №1:



где P – процент гетероплазмии
h –высота пика исследуемого нуклеотида,
N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей;
M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей.
 
Пример подсчета процента гетероплазмии мутантного аллеля митохондриального генома по мутации 652delG:
     Мутацию можно определить по пику нуклеотидов G. В анализируемой последовательности он находится под номером 2. По данным компьютерной программы, при 100% нормальных геномов ( G/G ) пик G составляет 2 единицы (рис.1, а), а при 100% геномов с делецией (-/-) пик G составляет 1 единицу (рис.1, б). В качестве контроля берем пик G №5, составляющий 2 единицы.
Например, определим процент данной мутации в образце ДНК, взятом
из стенки сосуда 50-летнего мужчины. Размер исследуемого пика G в данном образце составляет 15,73 (рис.1, в). Размер контрольного пика G – 18,29. Полагая, что 18,29 составляет 2 единицы, вычисляем размер исследуемого пика G в единицах. Он равен 1,72 ед. Это на 0,28 ед. меньше пика, характерного для 100% нормальных молекул ДНК. Далее вычисляем процент гетероплазмии по 652delG (формула №1):



Таким образом, данный образец ДНК имеет 28% гетероплазмии по 652delG.
 
Анализ интимы сонных артерий человека 



Рисунок 1. Детекция мутации 652delG ( [G]GTTTGGT )

а) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по отсутствию делеции G в позиции 652 в 100% митохондриальных хромосом;
б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по наличию делеции G в позиции 652 в 100% митохондриальных хромосом;
в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК (гетероплазмия
по наличию 652delG, 28% мутантных хромосом).
 
При статистической обработке данных по проценту гетероплазмии в образцах ДНК из лейкоцитов крови больных атеросклерозом и здоровых доноров, а именно анализе чувствительности-специфичности с построением ROC-кривой было установлено, что пороговым значением для показателя гетероплазмии по мутации
652delG является 9%. При этом условии выявлена сопряженность показателя гетероплазмии с наличием атеросклеротических бляшек. Показатель хи-квадрат составил 4,66 при р=0,031; коэффициент линейно-линейной связи составил 4,64 при р=0,031; коэффициент гамма составил 0,475 при р=0,022; коэффициент корреляции по Спирмену составил 0,156 при р=0,031. Отношение шансов составляет 2,8 (95% доверительный интервал 1,1-7,4), прогностическая ценность положительного результата анализа составляет 93% (95% доверительный интервал 87-97%).
Таким образом, средним пороговым уровнем для гетероплазмии по мутации 652insG в митохондриальной ДНК лейкоцитов крови человека, является 9%. Значение, превышающее данный пороговый уровень, соответствует высокой предрасположенности к атеросклерозу и формированию атеросклеротических бляшек.
 
           
Применение данных по проценту гетероплазмии мутации 652delG в практической медицине
Пример 1: Мужчина, 59 лет, индекс массы тела 28,3 кг/м2, артериальное давление 151/86 мм рт. ст., некурящий, общий холестерин 212 мг/дл, триглицериды 146 мг/дл, холестерин липопротеидов высокой плотности 59 мг/дл, холестерин липопротеидов низкой плотности 124 мг/дл. При ультразвуковом обследовании бассейна сонных артерий обнаружены гемодинамически незначимые возвышающиеся поражения до 30% артериального просвета, средняя толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 0,76 мм (соответствует возрастной норме). Степень гетероплазмии по мутации 652delG составляет 53%. Заключение: имеются минимальные признаки субклинического атеросклероза; имеется генетическая предрасположенность к развитию атеросклероза по мутации 652delG 
Пример 2: Женщина, 54 года, индекс массы тела 18,9 кг/м2, артериальное давление 108/67 мм рт. ст., некурящая, общий холестерин 200 мг/дл, триглицериды 68 мг/дл, холестерин липопротеидов высокой плотности 95 мг/дл, холестерин липопротеидов низкой плотности 92 мг/дл. При ультразвуковом обследовании бассейна сонных артерий возвышающихся поражений не выявлено, средняя толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 0,67 мм (соответствует возрастной норме). Степень гетероплазмии по мутации 652delG составляет 0%. Заключение: признаки субклинического атеросклероза отсутствуют; не имеется генетической предрасположенности к развитию атеросклероза по мутации 652delG.
Пример 3: Женщина, 60 лет, индекс массы тела 28,6 кг/м2, артериальное давление 150/80 мм рт. ст., некурящая, общий холестерин 232 мг/дл, триглицериды 87 мг/дл, холестерин липопротеидов высокой плотности 97 мг/дл, холестерин липопротеидов низкой плотности 118 мг/дл. При ультразвуковом обследовании бассейна сонных артерий обнаружены гемодинамически значимые возвышающиеся поражения свыше 50% артериального просвета, средняя толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 1,18 мм (превышает возрастную норму). Степень гетероплазмии по мутации 652delG составляет 54%. Заключение: имеются выраженные признаки субклинического атеросклероза; имеется генетическая предрасположенность к развитию атеросклероза по мутации 652delG.
 

Заключение

Полученные результаты показывают определенные различия в проценте гетероплазмии по делеции G в позиции 652 гена субъединицы 12S рибосомальной РНК   митохондриального генома человека между здоровыми людьми и пациентами с атеросклеротическими поражениями.
Таким образом, пороговый уровень гетероплазмии мутации митохондриального генома  652delG, равный 9%,  может служить прогностическим признаком атеросклероза сонных артерий у человека.
Статья может быть полезна медицинским генетикам, проводящим диагностику атеросклероза.
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.
 
Литература:

1. Consigny P.M. Pathogenesis of atherosclerosis. // A.J.R. Am. J. Roentgenol.,1995, Mar., V.164(3), P.553-558, Review.
2. Incalcaterra E., Hoffmann E., Averna M.R et al. Genetic risk factors in myocardial infarction at young age.// Minerva Cardioangiol., 2004, Aug.,V.52(4), P.287-312.
3. Т.Э. Иващенко, Д.Л. Стрекалов, Д.В. Соловьева и др. Тестирование генетической предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям и генетический паспорт.//  Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике, выпуск 5, “Альфа-Виста”, Новосибирск, 2004 г.    
4. В.С.Баранов, Е.В. Баранова, Т.Э. Иващенко и др. Геном человека
и “ гены предрасположенности” ( Введение в предиктивную медицину ). -  СПб.: Интермедика, 2000 г., 271 с.
5. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин А.В., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Прямая количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома.// Фундаментальные науки и практика, Материалы трудов второй международной телеконференции, 2010 г.,  т.1, №2, стр.19-21.
6. М.М. Иванова,  М.А. Сазонова, А.В. Желанкин, К.Ю. Митрофанов, З.Б. Хасанова, И.А. Собенин, В.А. Мясоедова, А.Ю. Постнов, А.Н. Орехов. Мутации митохондриального генома в патологии человека.// Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии. Материалы трудов третьей международной телеконференции, октябрь-ноябрь 2010 г.
7. Chen X, Prosser R, Simonetti S, Sadlock J, Jagiello G, Schon EA. Rearranged mitochondrial genomes are present in human oocytes.// Am J Hum Genet. 1995, Aug.,57(2), P.239-247.
8. Yeh JJ, Lunetta KL, van Orsouw NJ, Moore FD Jr, Mutter GL, Vijg J, Dahia PL, Eng C. Somatic mitochondrial DNA (mtDNA) mutations in papillary thyroid carcinomas and
differential mtDNA sequence variants in cases with thyroid tumours.// Oncogene. 2000,
Apr 13,19(16), P.2060-2066.
9. Nishigaki Y, Marti R, Hirano M. ND5 is a hot-spot for multiple atypical mitochondrial DNA deletions in mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy. //Hum Mol Genet. 2004, Jan 1,13(1), P.91-101.
10. Sazonova  MA, Budnikov EY, Khasanova ZB, Sobenin IA, Postnov AY, Orekhov AN. Studies of the human aortic intima by a direct quantitative assay of mutant alleles in the mitochondrial genome.// Atherosclerosis. 2009, May;204(1):184-190. Epub 2008, Sep 4.
11. Agaton C., Unneberg P., Sievertzon M. et al. Gene expression analysis by signature pyrosequencing.//  Gene, 2002, May 1, V. 289 ( 1 - 2 ), P. 31 - 39.
12. Wasson J., Scolnick G., Love-Gregory L.  et al. Assesing allele frequencies of single nucleotide polymorphisms in DNA pools by pyrosequencing technology.// BioTechniques, 2002, May, V.32, P.1144 - 1152.
13. Ronaghi. M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.// Genome Reseach, 2001, V.11, P. 3 - 11.
14. Alderborn A., Kristofferson A., Hammerling U. Determination of single-nucleotide polymorphisms by real-time pyrophosphate DNA sequencing. // Genome Res., 2000, Vol.10, P.1249-1258.
15. Chen D.C., Saarela J., Nuotio I., Jokiaho A., Peltonen L., Palotie A. Comparison of GenFlex Tag array and Pyrosequencing in SNP genotyping. // J. Mol. Diagn., 2003,Vol.5, P.243-249.
16. Sinclair A., Arnold C., Woodford N. Rapid detection and estimation by pyrosequencing of 23S rRNA genes with a single nucleotide polymorphism conferring linezolid resistance in Enterococci. // Antimicrob. Agents Chemother. 2003,Vol.47, P.3620-3622.