Сазонова МА, Иванова ММ, Желанкин АВ, Митрофанов КЮ, Хасанова ЗБ, Собенин ИА, Мясоедова ВА, Постнов АЮ, Орехов АН
Фундаментальные науки и практика 2010 1(4):168-171

Резюме

Проведен анализ процента гетероплазмии мутации 652insG  митохондриального генома человека. Полученные результаты показывают значительную гетероплазмию данной мутации  не только между различными участками интимы аорты, но и между лейкоцитами крови больных атеросклерозом и здоровых доноров.
Пороговый уровень гетероплазмии мутации митохондриального генома  652insG, равный 20%,  может служить прогностическим признаком атеросклероза сонных артерий у человека. 
 

Введение

В России, как и в большинстве индустриальных стран, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) занимают первое место в структуре инвалидизации и смертности, в том числе, преждевременной, а также ведут к эскалации расходов на здравоохранение. Поскольку морфологической основой смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в 90% случаев является атеросклероз, то вклад заболеваний атеросклеротического генеза и их последствий в России в общую смертность является наиболее весомым. Одной из причин этого неблагоприятного дисбаланса является недостаточное количество верифицированных биомаркеров ССЗ, и, в частности, атеросклероза.
По литературным данным, в патологии человека показана ассоциация различных заболеваний с некоторыми мутациями митохондриального генома [1-3]. Митохондриальные мутации ассоциируются с различными заболеваниями, часто встречающимися в сочетании с атеросклеротическими поражениями, такими как стеноз коронарных сосудов, некоторые формы диабета и глухоты, инфаркт миокарда, кардиомиопатия. 
Согласно одной из гипотез, мутации митохондриального генома вызывают окислительный стресс или свободно-радикальное окисление в организме человека.  Эта гипотеза объясняет широкий круг патологических процессов, вызванных митохондриальными мутациями. Помимо прямого разрушения клеток свободные радикалы часто являются виновниками таких заболеваний, как атеросклероз, болезни сердца и сосудов, диабет, онкологические заболевания и т.п. Появление и накопление мутаций  в митохондриальной ДНК вызывает увеличение перекисного окисления липидов и белков мембран, а также окислительное повреждение белков свободными радикалами.   
Следует отметить, что в каждой митохондрии содержится несколько копий ее генома. Митохондриальный геном наследуется по материнскому типу и отличается выраженной нестабильностью, в нем часто возникают мутации. Пенетрантность и экспрессивность таких мутаций варьируют в широких пределах от семьи к семье и между родственниками (по материнской линии) одной семьи и зависят от многих факторов, но главным образом, от генотипа и уровня гетероплазмии (смесь мутантных и нормальных молекул ДНК). Поэтому при изучении ассоциации митохондриальных мутаций с заболеваниями людей необходима не только качественная (наличие/отсутствие мутации), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии).
В настоящей работе проведен молекулярный анализ мутации 652insG  митохондриального генома человека в образцах ДНК из нормальной и пораженной атеросклерозом интимы аорты человека, а также из лейкоцитов крови пациентов, больных атеросклерозом и здоровых доноров. Мутация локализована в кодирующей области митохондриального генома, в частности, в гене рРНК 12S. Данная мутация вызывает дефект малой субъединицы рибосомальной РНК, вследствие чего нарушается синтез митохондриальных белков. По литературным данным, мутация 652insG ассоциирована с митохондриальными миопатиями  [4] .     
 

Материалы и методы

 
Материалом для данного исследования служили образцы ткани из интимы аорты, печени и мышцы, полученные из аутопсийного материала 7 лиц, погибших в результате несчастного случая или внезапной смерти. Кроме того, использовались образцы лейкоцитов крови 190 пациентов (84 мужчин в возрасте старше 30 лет, средний возраст 63,9 (SD=10,2) лет, и 106 женщин в возрасте старше 46 лет, средний возраст 65,8 (SD=8,6) лет).      
Образцы крови были взяты у пациентов, входящих в группу риска: страдающие одним из заболеваний, наиболее часто ассоциированных с атеросклерозом (артериальной гипертонией, сахарным диабетом 2 типа, ишемической болезнью сердца, острым инфарктом миокарда, бронхиальной астмой, нарушением мозгового кровоснабжения) или здоровых мужчин старше 40 лет и женщин старше 50 лет.
Для прижизненной диагностики атеросклероза использовали ультрасонографию высокого разрешения в В-режиме с использованием линейного сосудистого датчика с частотой 7,5 МГц с последующей компьютерной оценкой толщины интимо-медиального слоя (ТИМС) общих сонных артерий.
Для определения степени предрасположенности к атеросклерозу использовали пограничные возрастно-половые значения показателя ТИМС, представленные в таблице 1. Абсолютные значения показателя ТИМС были перекодированы в квартильные показатели ординарной шкалы (1, 2, 3 или 4) в соответствии с величинами межквартильных границ, представленными в таблице 1. При этом, независимо от пола и возрастной группы, принадлежность к 1-й квартили рассматривали как признак низкой предрасположенности к атеросклерозу, принадлежность к 4-й квартили – как признак высокой предрасположенности к атеросклерозу. Принадлежность ко 2-й и 3-й квартилям рассматривали как соответствие возрастной норме.
 
Таблица 1.
Показатели толщины интимо-медиального слоя общих сонных артерий у мужчин и женщин в зависимости от возраста.
 

При ультразвуковом обследовании также оценивали наличие атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий с использованием ординарной (балльной) шкалы: (0) отсутствие атеросклеротических бляшек; (1) наличие гемодинамически незначимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда до 20%; (2) наличие условно гемодинамически незначимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда от 20% до 50%; (3) наличие гемодинамически значимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда более 50%.
В обследованной выборке 83 человека (44%) не имели атеросклеротических бляшек в бассейне общих сонных артерий, 61 человек (32%) имели бляшки 1-й степени, 46 человек (24%) имели бляшки 2-3 степени. По толщине интимо-медиального слоя общих сонных артерий 49 человек (1-я квартиль) были идентифицированы как не предрасположенные к атеросклерозу, 44 человека (4-я квартиль) – как предрасположенные к атеросклерозу, 97 человек (2-3 квартили) – как имеющие возрастную норму.
     
Выделение ДНК
Выделение тотальной ДНК из образцов различных тканей (5-10 мг) или крови (5мл) проводилось с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Визуализацию результатов выделения ДНК проводили  с помощью электрофореза  в горизонтальном аппарате в 0,8% агарозном геле.
 
ПЦР
При амплификации фрагмента размером 467 п.н., содержащего область мутации 652insG, использовали следующие праймеры:
1.Прямой праймер TAGACGGGCTCACATCAC    ( 621 - 638 );
2.Обратный праймер bio-GGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGT ( 1087 -  1064 ).
Обратный праймер был биотинилирован в целях дальнейшего пиросеквенирования ПЦР-фрагмента.
Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 0,4 - 0,6 мкг митохондриальной ДНК; 16,6 мкМ (NH4)2SO4; 0,3 пикомоль каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 67 мМ трис/HCl ( pH 8,8 ), 2,5 mM MgCL2  и 3 ед. Taq-полимеразы.
Режим ПЦР: денатурация ДНК при 940 C в течение 3–х минут, затем:
940 C – 45 сек., 600 C –45 сек., 720 C –1 мин., всего – 35 циклов, с заключительным синтезом при 720 C  в течение 7 мин.
Детекцию продуктов ПЦР проводили  с помощью электрофореза  в горизонтальном аппарате в 1,5% агарозном геле.
 
Пиросиквенс
После проведения ПЦР амплификаты были пиросеквенированы для выявления инсерции G в гене субъединицы 12S в позиции 652 митохондриального генома человека. Исследования проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQTMHS96MA. При постановке эксперимента была использована схема приготовления проб, описанная в прилагающемся к пиросеквенатору методическом пособии.
Последовательность праймера для сиквенса была следующей:
CCCATAAACAAATA  (639 - 651).
Визуализация результатов осуществлялась с помощью программы, прилагающейся при установке пиросеквенатора.
Статистическая обработка
Статистическую обработку данных проводили при помощи статистического пакета SPSS 14.0 (SPSS Inc., США). Данные представляли в виде среднего значения с указанием стандартного отклонения.
 
Молекулярно-генетическая диагностика:
Диагностика пациентов на предрасположенность к атеросклерозу проводилась следующим образом:
1)Проводилось тестирование образцов ДНК, выделенных из ткани или лейкоцитов  крови индивидов на наличие мутации  652insG;
2)Расчитывался процента гетероплазмии мутации 652insG в данных образцах;
3) На основании полученных данных по молекулярно-генетической  диагностике и ультрасонографическому обследованию делался вывод о том, имеется ли у индивида предрасположенность к возникновению и развитию атеросклероза.
 

Результаты и обсуждение

 
Для количественной оценки мутантного аллеля, содержащего инсерцию G в позиции 652 митохондриального генома человека, мы использовали метод пиросеквенирования в нашей модификации. Метод пиросеквенирования основан на измерении вспышки, возникающей при взаимодействии АТФ с люциферином. Данная реакция катализируется ферментом люциферазой. Следует отметить, что АТФ образуется из пирофосфата, с помощью фермента сульфаразы. Пирофосфат (давший название всему методу пиросиквенса), в свою очередь, выделяется при взаимодействии нуклеотида, комплементарного нуклеотиду исследуемого биотинилированного одноцепочечного участка, с сиквенсовым праймером или очередным соседним нуклеотидом, которые уже встроены в комплементарную цепь [5-10].
Благодаря разработанному авторами статьи методу возможна не только качественная  (есть мутация или ее нет), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии ) в биологических образцах.
Для подсчета процента гетероплазмии используется ранее  разработанная авторами формула №1 :
,
где P – процент гетероплазмии
h –высота пика исследуемого нуклеотида,
N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей;
M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей.
 
Пример подсчета процента гетероплазмии мутантного аллеля митохондриального генома по мутации 652insG  :
Данную мутацию можно определить по пику нуклеотидов G. В анализируемой последовательности он находится под номером 2. По данным компьютерной программы, при 100% геномов с инсерцией ( +/+) пик G составляет 3 единицы (рис.1а), а при 100% нормальных геномов ( G/G ) пик G составляет 2 единицы (рис.1б). В качестве контроля берем пик G №5, составляющий 2 единицы.
Определим процент данной мутации в образце ДНК, взятом у 59-летней женщины, имеющей атеросклеротические поражения интимы сонных артерий. Размер исследуемого пика G (№2) в данном образце составляет 2,05 (рис.1в). Размер контрольного пика G (№5) – 1,90. Полагая, что это составляет  две единицы, вычисляем размер исследуемого пика G в единицах. Он равен 2,16 ед. Это на 0,16 ед. больше пика, характерного для 100% нормальных молекул ДНК. Размер исследуемого пика G при 100% мутантных геномов должен быть 2,85. Данные подставляем в формулу №1 и вычисляем процент гетероплазмии по 652delG:
  .
Таким образом, данный образец ДНК имеет 16% гетероплазмии по 652insG

 
Рисунок 1. Детекция мутации 652insG ( [G]GGTTTGGT )
а) гистограмма теоретической высоты пиков нуклеотидов при гомоплазмии по наличию инсерции G в позиции 652 в 100% митохондриальных хромосом;
б) гистограмма теоретической высоты пиков нуклеотидов при гомоплазмии по отсутствию инсерции G в позиции 652 в 100% митохондриальных хромосом;
в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК из лейкоцитов крови пациента, имеющего атеросклеротические поражения интимы сонных артерий (гетероплазмия по наличию 652insG составляет 16% мутантных хромосом ).
 
Результаты анализа интимы артерий человека:
При анализе нормальной и пораженной атеросклерозом интимы аорт  в 29% (2 из 7 аорт) выявлены значительные отличия в проценте гетероплазмии  аллеля митохондриального генома, несущего мутацию 652insG. Это дало основание для дальнейшего изучения данной мутации на предмет ассоциации с прижизненными атеросклеротическими поражениями у человека.
В образцах ДНК, выделенных из мононуклеарных клеток крови, процент гетероплазмии по мутации 652insG у лиц, имеющих стенозирующие атеросклеротические бляшки, был ниже, чем у здоровых доноров, p=0,026. Средний показатель гетероплазмии у лиц, не имеющих атеросклеротических бляшек, составил 22,6% (SD=19,3%), при наличии гемодинамически незначимых бляшек – 19,6% (SD=17,0%), при наличии умеренно выраженных бляшек – 19,0% (SD=19,1%), а у лиц, имеющих стенозирующие атеросклеротические бляшки, перекрывающие более 50% просвета сосудов – 6,0% (SD=8,5%). Односторонний вариационный анализ выявил взаимосвязь процента гетероплазмии по мутации 652insG со степенью выраженности атеросклеротических бляшек при p=0,033. Коэффициент корреляции составил -0,127 при p=0,049.
Процент гетероплазмии по мутации 652insG у лиц, имеющих ультразвуковые признаки предрасположенности к атеросклерозу (4-я квартиль ТИМС), был ниже, чем у лиц, не предрасположенных к атеросклерозу (1-я квартиль ТИМС), p=0,010. Средний показатель гетероплазмии у лиц, относящихся к 1-й квартили по ТИМС, составил 27,3% (SD=22,2%); у лиц, относящихся ко 2-й квартили по ТИМС – 17,7% (SD=17,3%); у лиц, относящихся к 3-й квартили по ТИМС – 19,8% (SD=14,6%); а у лиц, относящихся к 4-й квартили по ТИМС – 16,1% (SD=17,1%). Односторонний вариационный анализ выявил взаимосвязь процента гетероплазмии по мутации 652insG со степенью ТИМС общих сонных артерий при p=0,008. Коэффициент корреляции составил -0,164 при p=0,023.
Следует отметить, что при проведении анализа чувствительность-специфичность в отношении стенозирующих (более 50% просвета сосудов) с построением ROC-кривой было установлено, что площадь под кривой составила 0,745 при р=0,041 (95% доверительный интервал 0,604-0,886), а пороговым значением для показателя гетероплазмии по мутации 652insG является 19,5%.
В то же время при проведении анализа чувствительность-специфичность в отношении отсутствия предрасположенности к атеросклерозу по ТИМС с построением ROC-кривой было установлено, что площадь под кривой составила 0,619 при р=0,012 (95% доверительный интервал 0,527-0,712), а пороговым значением для показателя гетероплазмии по мутации 652insG является 20,5%.
Таким образом, средним пороговым уровнем для гетероплазмии по мутации 652insG в митохондриальной ДНК лейкоцитов крови человека, определенным двумя независимыми методами, является 20%. Значение, превышающее данный пороговый уровень, соответствует низкой предрасположенности к атеросклерозу и формированию атеросклеротических бляшек. Значение, не достигающее данного порогового уровня, соответствует высокой предрасположенности к атеросклерозу и формированию стенозирующих атеросклеротических бляшек.
 

Заключение

 
Полученные, в ходе данного исследования, результаты показывают значительную гетероплазмию по инсерции G в позиции 652 гена субъединицы 12S рибосомальной РНК   митохондриального генома человека  не только между различными участками интимы аорты, но и между лейкоцитами крови больных атеросклерозом и здоровых доноров.
Таким образом, пороговый уровень гетероплазмии мутации митохондриального генома  652insG, равный 20%,  может служить прогностическим признаком атеросклероза сонных артерий у человека. 
 
Литература:
1. Andreassi M.G. Coronary atherosclerosis and somatic mutations: an overview of the contributive factors for oxidative DNA damage. // Mutat. Res., 2003, Jan., V. 543(1), P. 67-86. Review.
2. Andreassi M.G., Botto N. DNA damage as a new emerging risk factor in atherosclerosis.// Trends. Cardiovasc. Med. , 2003, Oct;13(7), P.270-275. Review.
3. Andreassi M.G., Botto N., Colombo M.G et al. Genetic instability and atherosclerosis: can somatic mutations account for the development of cardiovascular diseases?// Environ. Mol. Mutagen, 2000,35(4), P.265-269. Review.
4. Han CB, Ma JM, Xin Y, Mao XY, Zhao YJ, Wu DY, Zhang SM, Zhang YK.. Mutations of mitochondrial 12S rRNA in gastric carcinoma and their significance.// World Gastroenterol. 2005 Jan 7;11(1):31-5.
5. Agaton C., Unneberg P., Sievertzon M. et al. Gene expression analysis by signature pyrosequencing.//  Gene, 2002, May 1; V. 289 ( 1 - 2 ), P. 31 - 39.
6. Wasson J., Scolnick G., Love-Gregory L.  et al. Assesing allele frequencies of single nucleotide polymorphisms in DNA pools by pyrosequencing technology.// BioTechniques, 2002, May, V.32, P.1144 - 1152.
7. Ronaghi. M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.// Genome Reseach, 2001, V.11, P. 3 - 11.
8. Alderborn A., Kristofferson A., Hammerling U. Determination of single-nucleotide polymorphisms by real-time pyrophosphate DNA sequencing. // Genome Res. 2000.-Vol.10.-pp.1249-1258.
9. Chen D.C., Saarela J., Nuotio I., Jokiaho A., Peltonen L., Palotie A. Comparison of GenFlex Tag array and Pyrosequencing in SNP genotyping. // J. Mol. Diagn. 2003.-Vol.5.-pp.243-249.
10. Sinclair A., Arnold C., Woodford N.. Rapid detection and estimation by pyrosequencing of 23S rRNA genes with a single nucleotide polymorphism conferring linezolid resistance in Enterococci. // Antimicrob. Agents Chemother. 2003.-Vol.47.-pp.3620-3622.